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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/3546| Desarrollo de exosomas funcionalizados para entrega de ARNm en el nicho pre-metastásico de tejido hepático Development of functionalized exosomes to deliver of mRNA in the pre-metastasic niche of hepatic tissue | |
| VERONICA CASTRO FLORES | |
| PIERRICK GERARD JEAN FOURNIER | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| cáncer, páncreas, nicho pre-metastásico, exosomas, integrinas, ARNm cancer, pancreas, pre-metastatic niche, exosomes, integrins, RNAm | |
| La metástasis es la responsable del 90% de las muertes de pacientes con cáncer. Los exosomas son vesículas extracelulares que transportan ADN, ARN y proteínas, involucrados en la comunicación intercelular durante procesos fisiológicos normales y patológicos. Los exosomas derivados del tumor primario inducen la formación del nicho pre-metastásico, y favorecen el establecimiento de la metástasis. La integrina αvβ5 dirige los exosomas hacia el hígado, principal sitio de metástasis en cáncer pancreático. En este proyecto, se propone producir exosomas funcionalizados con αvβ5 y utilizarse como vehículos dirigidos a hígado para detener la formación del nicho pre-metastásico. Para esto, se co-transfectaron células 293T con plásmidos que contienen las secuencias codificantes de las integrinas αv y β5. Se seleccionaron las células transfectadas, y se confirmó por Western-blot la presencia de las integrinas. La citometría de flujo indicó una población celular policlonal que expresa altos niveles de la integrina, por esto, se aislaron sub-clonas por dilución límite. Se seleccionaron dos sub-clonas con una expresión de αvβ5 seis veces mayor que en las células control. Se cultivaron las sub-clonas sin antibiótico de selección y una de ellas mantuvo la expresión de αvβ5, indicando la estabilidad de la transfección. Se aislaron exosomas de células 293T-αvβ5. Se confirmó su diámetro hidrodinámico por dispersión de luz dinámica (90-170nm), pero no fue posible obtener suficientes proteínas para confirmar la presencia de αvβ5 en los exosomas. Para evaluar la transferencia de información de los exosomas, se transfectaron células 293T-αvβ5 para que sobreexpresaran GFP (Green Fluorescent Protein, por sus siglas en inglés). El medio con exosomas fue cultivado con macrófagos de ratón, en donde se observó la presencia de GFP. Aunque no fue posible confirmar la presencia de αvβ5 en los exosomas derivados de células 293T-αvβ5-GFP+, los resultados sugieren que pueden usarse para transferir información. Se necesitarán experimentos adicionales para confirmar que estos exosomas se dirigen a hígado para usarse como inhibidores del nicho pre-metastásico. Metastasis is responsible for 90% of deaths in cancer patients. Exosomes are extracellular vesicles that carry DNA, RNA, and proteins; they are involved in intercellular communication during normal and pathological physiological processes. Exosomes derived from the primary tumor induce the formation of the pre-metastatic niche, which favors metastasis. The αvβ5 integrin directs exosomes to the liver, the main site of metastasis in pancreatic cancer. The aim of this study is to produce αvβ5 functionalized exosomes and use them as liver-targeting vehicles to arrest pre-metastatic niche formation. In this work, 293T cells were co-transfected with plasmids containing αv and β5 integrins coding sequences. The transfected cells were selected, and the presence of the integrins was confirmed by Western blot. However, flow cytometry indicated a polyclonal cell population that expresses high integrin levels, for which sub-clones were isolated by limiting dilution. Two sub-clones were selected with a six-fold higher expression of αvβ5 than in 293T-wt cells. The sub-clones were cultured without a selection antibiotic, and one of them maintained the expression of αvβ5, indicating the stability of the transfection. Exosomes derived from 293T-wt and - αvβ5 cells were isolated. Their hydrodynamic diameter was confirmed by dynamic light scattering (90-170nm), but it was not possible to obtain enough proteins to confirm the presence of αvβ5 in the exosomes. To assess exosome charge transfer, 293T- αvβ5 cells were transfected to overexpress GFP. Their exosome-conditioned medium was cultured with mouse macrophages, in which the presence of GFP was observed. Although it was possible to confirm the presence of αvβ5 in exosomes derived from 293T-αvβ5-GFP+ cells, the results suggest that they can be used to transfer information. Future experiments are needed to confirm that these exosomes target the liver for use as inhibitors of the pre-metastatic niche. | |
| CICESE | |
| 2021 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| Castro Flores. V. 2021. Desarrollo de exosomas funcionalizados para entrega de ARNm en el nicho pre-metastásico de tejido hepático. Tesis de Maestría en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 52 pp. | |
| OTRAS | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
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| Veronica Castro Flores-08-mar-2021.pdf | Versión completa de la tesis | 2.76 MB | Adobe PDF | Visualizar/Abrir |