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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/1147| Producción de la hormona recombinante hiperglucémica de crustáceos (CHH) e inhibidora de la muda (MIH) del camarón blanco Litopenaeus vannamei Production of recombinant crustacean hipergycemic hormone (CHH) and molt-inhibiting hormone (MIH) of the white shrimp Litopenaeus vannamei | |
| Edna Sánchez Castrejón | |
| Elizabeth Ponce Rivas | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Litopenaeus vannamei,Proteínas recombinantes,Ciencias del mar | |
| El complejo OX-GS es considerado el principal órgano endócrino en crustáceos ya que sintetiza una serie de hormonas que intervienen en númerosos e importantes procesos fisiológicos. Entre las hormonas sintetizadas por este complejo, destaca la familia CHH/MIH/GIH la cual está relacionada con el desarrollo, crecimiento y reproducción del camarón. A pesar de la importancia de estas hormonas sus mecanismos de acción endócrina son poco conocidos, ya que estos estudios requieren de cantidades suficientes de hormonas las cuales son difíciles de obtener directamente de los animales. Es por ello que la tecnología del ADN recombinante representa una alternativa para la producción de estas hormonas las cuales puedan ser utilizadas en diferentes estudios fisiológicos así como de estructura-función. En este trabajo se presenta la clonación y expresión de los genes chh y mih de Litopenaeus vannamei para la producción de la hormona recombinante hiperglucémica de crustáceos (CHH) e inhibidora de la muda (MIH) a partir de un vector de expresión para Pichia pastoris el cual es inducible por metanol (pPICZαA) y presenta una señal de secreción (α- factor). Con el propósito de obtener proteínas recombinantes lo más parecidas a sus formas nativas, los genes fueron clonados con sus respectivos condones de término lo que interrumpió la traducción de las secuencias presentes en el vector de expresión que permiten el reconocimiento y purificación de las proteínas producidas. Una vez que se comprobó la correcta inserción de los genes en las clonas transformadas de P. pastoris (X- 33) por secuenciación, se procedió con el ensayo de inducción donde se determinaron las condiciones óptimas para la producción de las respectivas proteínas. El análisis de secuenciación del N-terminal de MIHn purificada por exclusión molecular y RP-HPLC evidenció la presencia de aminoácidos extras debido a un procesamiento incorrecto de las repeticiones Glu-Ala por la proteasa Kex2. Dado lo anterior se procedió con una nueva construcción en la que se incluyó un sitio de reconocimiento para la proteasa Enteroquinasa y la eliminación de las secuencias correspondientes a las repeticiones Glu-Ala. Como en el caso anterior, se verificó la correcta inserción de los genes y las condiciones óptimas para la producción de las proteínas en P. pastoris (KM71). El análisis de Western blot comprobó la síntesis de la hormona recombinante MIHHis. El rendimiento obtenido para esta proteína recombinante fue de 8.7 mg·l<sup>-1</sup>, el cual es superior al de otras hormonas recombinantes de camarón producidas en Pichia. El análisis de secuenciación de MIHHis indicó que la eliminación de las repeticiones Glu-Ala no afectó el procesamiento de la señal α-factor. Por otro lado, el sitio de reconocimiento para la enzima Enteroquinasa fue reconocido e hidrolizado exitosamente por la enzima. La actividad hiperglucémica de MIHHis fue corroborada mediante un ensayo in vivo, sin embargo no se descarta que también presente un efecto inhibitorio en la muda. Asimismo se obtuvieron anticuerpos policlonales de conejo contra un péptido sintético de MIH, obteniéndose un título alto de anticuerpos. Estos reconocieron a la hormona recombinante MIHHis por Western blot y mediante ensayos de ELISA se demostró que tienen un nivel de sensibilidad de 6.3 ng de proteína por lo que no fue posible utilizarlos para determinar los niveles de MIH a partir del extracto de glándula y hemolinfa por un ensayo de ELISA. Con lo que respecta a CHHHis esta no fue observada en los análisis en Western blot. Los ensayos de RT-PCR realizados evidenciaron la trascripción de chh, lo que se sugirió que el problema fue a nivel traduccional o postraduccional. Los anticuerpos anti-CHH obtenidos con un péptido sintético mostraron un alto título y los ensayos de Western blot mostraron dos bandas (15 y 30 kDa) en las muestras de extracto de glándulas que aunque no corresponden al tamaño esperado de CHH no se descarta la posibilidad de que sean multímeros de CHH ya que la proteína nativa es de 8-9 kDa. The OX-GS complex is considered the main endocrine organ in crustacean and the hormones produced play a central role in numerous and important physiological processes. Among these hormones, the CHH/MIH/GIH peptide family plays important roles in controlling the development, growth and reproduction of shrimp. Despite the importance of the peptide family the studies about endocrine mechanism are scare since they request large quantities of peptides that are not easy to obtain directly from the animal. Recombinant DNA technology is a good alternative to obtain large quantities of hormones that can be used for different physiological and structure-function studies. In this study the cloning and expression of chh and mih genes of Litopenaeus vannamei for the production of recombinant hyperglycemic crustacean hormone (CHH) and inhibiting molt hormone (MIH) are presented. A methanol inducible expression vector (pPICZαA) with a secretion signal sequence (α-factor) for Pichia pastoris yeast was used. To obtain recombinant proteins similar to the natives, chh and mih genes were cloned with their native stop codons. This caused that the sequences used for the purification and antibody recognition of the expression vector were not translated in the recombinant proteins. The strain P. pastoris X-33 was transformed and the correct insertion of genes analyzed by sequencing. Pichia transformants were induced and the optimal conditions for expression of recombinant proteins determined. The N-terminal sequencing analysis of MIHn protein purified by size exclusion chromatography and RP-HPLC revealed the presence of extra amino acid residues due to the incorrect processing of the Glu-Ala repeats by Kex2 protease in the yeast secretory pathway. Because of the results obtained a new vector was constructed to include an Enterokinase site and eliminate the Glu-Ala repeats. The new insertion was verified from the P. pastoris KM71 transformants and the optimal conditions for the protein expression were determined. The recombinant MIHHis protein was detected by a Western blot analysis. The final yield obtained for MIHHis (8.7 mg·l<sup>-1</sup>) was higher that the yields obtained for other shrimp recombinant hormones expressed in Pichia. The Nterminal sequence analysis confirmed that the Glu-Ala repeats elimination did not affect the correct processing of α-factor. The Enterokinase site was successfully recognized and cleaved by the Enterokinase enzyme. MIHHis hyperglycemic activity was suggested by an in vivo assay. However, the possibility of an additional molt inhibiting activity by the protein was no discarded. Polyclonal antibodies were produced by immunizing rabbits with synthetic peptides of CHH and MIH and high titers of antiserum were obtained. MIH antiserum recognized MIHHis by Western blot and the ELISA assay showed a sensibility of iv detection of 6.3 ng, making impossible its detection from the sinus gland extracts or hemolymph samples by an ELISA assay. With respect to CHHHis, it was not detected by Western blot analysis. Since the transcription of the chh gene was demonstrated by the RT-PCR analysis, translational or postranslational problems are suggested. Western blot analysis of the sinus gland extracts obtained using the CHH antiserum showed two bands (15 and 30 kDa), which not correspond to the expected size of the native CHH protein (8-9 kDa). However, it is possible that they correspond to CHH multimers. | |
| CICESE | |
| 2008 | |
| Tesis de doctorado | |
| Español | |
| Sánchez Castrejón, E.2008.Producción de la hormona recombinante hiperglucémica de crustáceos (CHH) e inhibidora de la muda (MIH) del camarón blanco Litopenaeus vannamei.Tesis de Doctorado en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California.138 pp. | |
| MICROBIOLOGÍA | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias |
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