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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/1172| Caracterización molecular y análisis de expresión de genes potenciales de piruvato cinasa (pyk1 sll0587 y pyk2 sll1275) en la cianobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 Molecular characterization and expression analysis of potential genes ofpyruvate kinase (pyk1 sll0587 and pyk2 sll1275) in the cyanobacteriumSynechocystis sp. PCC 6803 | |
| Dante Alberto Magdaleno Moncayo | |
| Elizabeth Ponce Rivas | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Piruvato cinasa,Pyruvate kinase,Synechcystis sp.,Expresión de genes | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 es una eubacteria Gram-negativa modelopara el estudio de rutas metabólicas ya que es competente natural y presenta uncrecimiento fotoautotrófico y fotoheterotrófico en presencia de glucosa. El genomade este microorganismo se encuentra secuenciado en su totalidad, lo cual hapropiciado el desarrollo de estudios in silico de transcriptomas, proteomas ymetabolomas. En el genoma de esta cianobacteria se encuentran dos secuencias,en diferentes regiones del genoma, que son potenciales de codificar para dospiruvato cinasas diferentes Pyk1 sll0587 y Pyk2 sll1275. La caracterización deestas dos secuencias es de gran importancia ya que la piruvato cinasa es la últimaenzima que interviene en una de las rutas del metabolismo del carbono de granimportancia como la glicólisis, formando piruvato y ATP a partir defosfoenolpiruvato. En este sentido resulta de gran interés el estudiar si estacianobacteria presenta uno o dos genes de piruvato cinasa, si estos estánregulados en forma diferencial, si codifican para dos isoenzimas y de ser así, siestas están controladas por reguladores alostéricos diferentes como en otrosorganismos. Con base a lo anterior el objetivo del presente trabajo fue el llevar acabo la caracterización molecular y análisis de expresión de los dos genespotenciales de piruvato cinasa (pyk1 sll0587 y pyk2 sll1275) en la cianobacteriaSynechocystis sp. PCC 6803.El análisis de aminoácidos de las secuencias de Pyk1 sll0587 y Pyk2sll1275 de Synechocystis sp. PCC 6803 con secuencias de piruvato cinasa deotras bacterias mostró la presencia de sitios conservados característicos de lasenzimas Pyk. Entre los sitios conservados importantes están el sitio de unión afosfoenolpiruvato y los sitios de unión a ATP/ADP y a cationes monovalentes ydivalentes. Pyk2 presentó un extremo C-terminal largo de 99 aa como las piruvatocinasas del género Bacillus, el cual contiene un motivo de unión afosfoenolpiruvato. Pyk2 también mostró un alto grado de homología de con otraspiruvato cinasas que se activan con AMP como la de G. stearothermophilus ySynechococcus sp. PCC 6301, lo que sugiere que Pyk2 también pudiera seractivada por AMP.Para llevar a cabo la interrupción de los genes pyk se diseñaron dosmetodologías diferentes: interrupción por digestión e interrupción poramplificación. Al utilizar la metodología de digestión con enzimas de restricción nose logró la interrupción de los genes pyk probablemente debido a que se utilizaronlos genes completos, cuya secuencia podría resultar tóxica a la célula como se haencontrado en otros organismos. La metodología de amplificación consistió endiseñar oligonucleótidos con bases homólogas a los genes pyk1 sll0587 y pyk2sll1275 y bases que hibriden a casetes de resistencia a antibióticos que permitanamplificar los casetes y realizar la interrupción de los genes pyk en el cromosomade la cianobacteria por recombinación homóloga. Las amplificaciones por PCRpermitieron comprobar la interrupción de los genes pyk1 sll0587 y pyk2 sll1275 yen el genoma de Synechocystis sp. PCC 6803. Sin embargo, no se lograronobtener transformantes en las condiciones de selección utilizadas (BG11+glucosay BG11+succinato). Por otro lado, se realizó el análisis de expresión de los dosgenes potenciales de piruvato cinasa por medio de RT-PCR. Las muestras fueronobtenidas de cultivos de la cianobacteria en condiciones fotoautotróficas yexponiendo los cultivos a tres diferentes condiciones (fotoautotróficas, oscuridadpor 48 horas y oscuridad por 48 horas con glucosa durante los últimos 60 minutosde incubación). La expresión del gen pyk1 sll0587 fue inducida en oscuridad y enoscuridad con glucosa, mientras que el gen pyk2 sll1275 se expresó cuandoSynechocystis sp. PCC 6803 fue cultivada en condiciones fotoautotróficas ycuando estos cultivos fueron transferidos a oscuridad en presencia de glucosa.Los resultados mostraron que la expresión de los genes pyk1 sll0587 y pyk2sll1275 se da forma diferencial. Synechocystis sp. PCC 6803 is a Gram-negative eubacteria model for the study of metabolic pathways as it is natural competent and has a photoautotrophic and photoheterotrophs growth in the presence of glucose. The complete genome sequence of this microorganism has been obtained, which has led to the development of in silico studies of transcriptomics, proteomics and metabolomics. In the genome of this cyanobacterium are two sequences, in different regions of the genome that potentially encode for two different pyruvate kinases: Pyk1 sll0587 and Pyk2 sll1275. The characterization of these two sequences is of great importance since the pyruvate kinase is the last enzyme involved in the route of carbon metabolism of glycolysis, forming pyruvate and ATP from phosphoenolpyruvate. In this regard it is of great interest to study whether this cyanobacterium has one or two genes for pyruvate kinase, if they are differentially regulated, if they code for two different isoenzymes and if they are controlled by different allosteric regulators as in other organisms. Based on the above, the aim of this work was to perform the molecular characterization and expression analysis of the two potential genes of pyruvate kinase pyk1 sll0587 and pyk2 sll1275 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. The amino acid analysis of the sequences of Pyk1 sll0587 and Pyk2 sll1275 from Synechocystis sp. PCC 6803 with pyruvate kinase sequences from other bacteria showed the presence of conserved sites characteristic of Pyk enzymes. Between the important conserved sites are the phosphoenolpyruvate binding site and the binding sites for ATP/ADP and monovalent and divalent cations. Pyk2 presents a long C-terminal of 99 aa as in the pyruvate kinases of genus Bacillus, which presents a phosphoenolpyruvate binding motif. Pyk2 also shows a high homology to other pyruvate kinases that are activated by AMP as in G. stearothermophilus and Synechococcus sp. PCC 6301, suggesting that Pyk2 could also be activated by AMP. To perform the disruption of the pyk genes two different methodologies were designed: digestion disruption and interruption by amplification. The disruption of pyk genes was not achieved by using the method of digestion with restriction enzymes probably because the whole pyk genes were used, whose sequence could be toxic to the cell as has been found in other organisms. The amplification methodology consisted of designing oligonucleotides with bases homologous to pyk1 sll0587 and pyk2 sll1275 genes and bases that prime to antibiotic resistance cassettes that allow amplification of the cassettes and enhancement of the chromosomal disruption of the cyanobacterium pyk genes by homologous recombination. The PCR amplifications made it possible to verify the disruption of genes pyk1 sll0587 and pyk2 sll1275 and in the genome of Synechocystis sp. PCC 6803. However, no transformants could be obtained with the selection conditions used (BG11 + glucose and BG11 + succinate). Subsequently, the gene expression analysis of the two potential pyruvate kinase genes was performed using RT-PCR. Samples were obtained from cyanobacteria cultures under photoautotrophic conditions, and later exposure at three different conditions (photoautotrophic, dark for 48 hours and darkness for 48 hours with glucose during the last 60 minutes of incubation). Expression of the gene pyk1 sll0587 was induced in darkness and in darkness with glucose, while the gene pyk2 sll1275 was expressed when Synechocystis sp. PCC 6803 was grown under photoautotrophic conditions and when these cultivations were transferred to darkness in the presence of glucose. The results showed the differential expression of genes pyk1 sll0587 and pyk2 sll1275. | |
| CICESE | |
| 2010 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| Magdaleno Moncayo, D.A.2010.Caracterización molecular y análisis de expresión de genes potenciales de piruvato cinasa (pyk1 sll0587 y pyk2 sll1275) en la cianobacteria Synechocystis sp. PCC 6803.Tesis de Maestría en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California.74 pp. | |
| MICROBIOLOGÍA | |
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