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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/1176| Clonación y expresión de la isoforma 2 de la hormona hiperglucémica de crustáceos de Litopenaeus vannamei (Liv-CHH-SG2) en Pichia pastoris Cloning and expression of the crustacean hyperglycemic hormone isoform 2 from Litopenaeus vannamei (Liv-CHH-SG2) in Pichia pastoris | |
| Haydeé López Rodríguez | |
| Elizabeth Ponce Rivas | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Proteínas recombinantes,Litopenaeus vannamei,Pichia pastoris,hormona hiperglucémica,Crustáceos,Ciencias del mar | |
| La fisiología de los crustáceos está regulada por las neurohormonas peptídicas de la familia CHH/MIH/GIH, las cuales se producen y liberan a la hemolinfa por el complejo órgano X- glándula del seno (OX-GS). La neurohormona hiperglucémica de crustáceos (CHH) está involucrada en la regulación y metabolismo de carbohidratos y lípidos, así como también en los procesos de muda, reproducción y osmorregulación. Dentro del grupo de las neurohormona CHH se han identificado isoformas producidas por corte y empalme alternativo del gen chh. En Litopenaeus vannamei se han encontrado dos isoformas de este tipo: Liv-CHHSG1 y Liv-CHH-SG2. Los 40 primeros aminoácidos de los péptidos maduros son idénticos, pero presentan una composición muy diferente en los últimos 30-31 aminoácidos del C-terminal. Los neuropéptidos de la familia CHH son difíciles de estudiar ya que son sintetizados en cantidades pequeñas y son similares en tamaño y estructura a otros neuropéptidos producidos en el pedúnculo ocular lo que dificulta su aislamiento y purificación. La tecnología del ADN recombinante es una herramienta útil para producir los neuropéptidos en cantidades suficientes para estudiar su papel fisiológico y las relaciones estructura-actividad. El ADNc de Liv-CHH-SG1 ha sido clonado y expresado en la levadura metilotrófica Pichia pastoris y se determinó su actividad biológica. Sin embargo, Liv-CHH-SG2 no ha sido clonada ni expresada. En el presente trabajo se obtuvo el transcrito chh-sg2 de camarones sometidos a estrés (salinidad y temperatura) y a través de reacciones de RT-PCR se obtuvo el ADNc. El transcrito fue clonado y expresado en P. pastoris. Se obtuvieron dos diferentes construcciones: CHH-SG2STOP y CHH-SG2EK. Para obtener la hormona nativa (CHH-SG2STOP) el ADNc de chh-sg2 fue amplificado utilizando unos cebadores que adicionaron el codón del aminoácido glicina antes del codón de término, para que pueda ser amidada después de purificarla. En la segunda construcción, se agregó el sitio de reconocimiento de enterocinasa antes del epitopo c-myc y la secuencia de polihistidinas, para poder remover estas etiquetas después de purificación de CHH-SG2EK. Ambas construcciones se linearizaron para ser integradas en el genoma de P. pastoris KM71. Una vez integradas, se determinaron las condiciones de expresión para ambas proteínas. Los resultados sugieren que bajo las condiciones probadas, P. pastoris expresa otra proteína del mismo peso molecular que CHH-SG2STOP. Las condiciones óptimas de expresión para CHH-SG2EK fueron con metanol al 4% durante un día. La proteína CHH-SG2EK, con un peso molecular aparente de 12.61 kDa, fue detectada en geles de de Tricina-SDS-PAGE y confirmada mediante un ensayo de Western Blot utilizando un anticuerpo anti-c-myc. The crustacean physiology is regulated by neuropeptide hormones of the CHH/MIH/GIH family, which are produced and secreted to hemolymph via the Xorgan-sinus gland complex (XO-SG).The crustacean hyperglycemic hormone (CHH) is involved in the regulation and metabolism of carbohydrates and lipids, as well in the processes of molting, reproduction and osmoregulation. Within the CHH neurohormone group, different isoforms produced by alternative splicing of the chh gene have been identified. In Litopenaeus vannamei two isoforms have been detected: Liv-CHH-SG1 and Liv-CHH-SG2. The first 40 residues of the mature peptides are identical, but they have a very different composition in the last 30-31 amino acid residues of the C-terminal. Neuropeptide members of the CHH family are difficult to study because they are synthesized in small quantities and similarities in size and primary structure to other eyestalk neuropeptides limit their isolation and purification. DNA recombinant technology is useful in generating these crustacean peptides in sufficient quantities to enable further study of their physiological roles and structure-activity relationships. Liv-CHH-SG1 cDNA has already been cloned and expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris and its biological activity has been determined. However, Liv-CHH-SG2 has not been cloned and expressed. In this work, the chh-sg2 transcript was obtained from shrimps submitted to stressful conditions (salinity and temperature) and RT-PCR reactions were performed to obtain cDNA. The transcript was cloned and expressed in Pichia pastoris. Two different constructions were obtained: CHH-SG2STOP and CHHSG2EK. To obtain the native hormone (CHH-SG2STOP) chh-sg2 cDNA was amplified using primers that add the glycine codon before the stop codon, so the recombinant hormone could be amidated after purification. For the second construction, the enterokinase recognition site was added before the c-myc epitope and the polyhistidine tag sites, so these tags could be removed after purification of CHH-SG2EK. Both constructions were linearized to be integrated into the Pichia pastoris KM71 genome. Once integrated, expression conditions were determined for both recombinant proteins. Results suggested that under the conditions tested, P. pastoris expressed a protein of the same molecular weight of CHH-SG2STOP. Optimal conditions for the expression of CHH-SG2EK were 4% methanol for one day. The CHH-SG2EK protein, which had an apparent molecular weight of 12.61 kDa, was detected in Tricine-SDS-PAGE analysis and confirmed by Western Blot assay with the anti-c-myc antibody | |
| CICESE | |
| 2009 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| López Rodríguez, H.2009.Clonación y expresión de la isoforma 2 de la hormona hiperglucémica de crustáceos de Litopenaeus vannamei (Liv-CHH-SG2) en Pichia pastoris.Tesis de Maestría en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California.66 pp. | |
| MICROBIOLOGÍA | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias |
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