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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/1177| La Rab GTPasa SEC-4 participa en la morfogénesis de hifas de Neurospora crassa The Rab-GTPase SEC-4 has a role in hyphal morphogenesis of neurospora crassa | |
| Ana Isabel García Santiago | |
| Meritxell Riquelme Pérez | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Vesícula, Vesicles, Morfogénesis, Morphogenesis, Ciencias del mar | |
| El ápice de las hifas de Neurospora crassa presenta una acumulación de vesículas secretoras que forman el Spitzenkörper (Spk), cuya función principal es dirigir el crecimiento. En levaduras, la fusión de las vesículas a la membrana plasmática en los sitios de crecimiento depende de la función de la Rab (por sus siglas en inglés Ras-related protein in brain) GTPasa Sec4p y su activador GEF (por sus siglas en inglés Guanine nucleotide Exchange Factors) Sec2p. La Sec4p es modificada postraduccionalmente por la unión covalente de isoprenoides a residuos de cisteína en la región carboxilo terminal (Cterminal), necesarios para su asociación con la membrana plasmática de la vesícula. Para que Sec4p pueda asociarse a las vesículas generadas en el Golgi necesita ser activada por Sec2p, el cual, induce a Sec4p a intercambiar GDP por GTP. Estudios mutagénicos de Sec4p y Sec2p en levaduras, demuestran que la ausencia de estas proteínas producen un fenotipo letal y causan una acumulación de vesículas en el citoplasma. Este estudio trata de entender el papel de SEC-4 y SEC-2 en la ruta secretora, y conocer los efectos provocados por la ausencia de estos genes en la morfogénesis de hifas y en la formación del Spk en el hongo filamentoso Neurospora crassa. El análisis mediante microscopía confocal de escaneo con láser de cepas expresando SEC-4 etiquetada con GFP en su extremo Cterminal, demostró que la región C-terminal posee dominios requeridos para su correcta localización. Contrariamente a lo observado en levaduras, en N. crassa la eliminación de sec-4 (NCU01911.2) ó sec-2 (NCU06404.2) no es letal. Sin embargo, la eliminación de sec-2 (Δsec-2) no repercute en la morfología o la tasa de crecimiento de las hifas durante el crecimiento vegetativo. Por el contrario, la eliminación de sec-4 (TGasa-1) tiene repercusiones desfavorables: 1) La tasa de crecimiento disminuye drásticamente (3.0 µm min-1) comparada con la del control (FGSC# 9718; 23.0 µm min<sup>-1</sup>). 2) La morfología tubular de las hifas y el comportamiento del Spk son aberrantes. Observamos por microscopía de contraste de fases que N. crassa TGasa-1 presenta variaciones en el diámetro hifal, hifas helicoidales y un incremento en el número de septos y ramas. El Spk, presentó movimientos abruptos que originaron cambios repentinos de dirección del crecimiento que deformaron el ápice hifal; asimismo el Spk presentó un diámetro menor (0.49-1.25 µm) que el de la cepa control (0.86-1.6 µm). También observamos, la formación de septos cercanos al ápice (10-20 µm) en hifas dañadas, formación de ramas abortivas y una ramificación inusual. En la región distal observamos la acumulación de vacuolas y zonas constreñidas. 3) El ensamblaje del exocisto se ve impedido. El análisis por microscopía confocal de escaneo con láser de la progenie de las cruzas de N. crassa TGasa1 con dos componentes del exocisto SEC-5 y SEC-15, etiquetados con GFP, demostraron que SEC-4 es necesaria para el correcto ensamblaje del exocisto, ya que la ausencia de SEC-4 deslocaliza la fluorescencia de SEC-5-GFP y SEC-15-GFP. Por lo anterior, proponemos que el papel de SEC-4 en N. crassa es el de favorecer el proceso de reconocimiento y fusión de vesículas a la membrana plasmática en colaboración con el exocisto para optimizar la exocitosis. The apex of Neurospora crassa hyphae presents an accumulation of secretory vesicles that constitute the Spitzenkörper, whose main function is to direct growth. In yeast, vesicle fusion with the plasma membrane at sites of growth depends on the function of Rab (Rasrelated protein in brain) GTPase Sec4p and its activator GEF Sec2p (Guanine nucleotide Exchange Factors). Sec4p is modified by covalent posttranslational addition of an isoprenoid group to cysteine residues in the carboxil terminal region (C-terminal), necessary for its association with vesicles. For Sec4p to associate with vesicles generated in Golgi, it needs to be activated by Sec2p. This induces Sec4p to exchange GDP for GTP. Mutagenesis studies of Sec4p in yeast demonstrated that the absence of this protein results in a lethal phenotype and causes an accumulation of vesicles in the cytoplasm. The aim of this study was to better understand the role of SEC-4 and SEC-2 in the secretory pathway and to identify the effects of deleting these genes on the morphology of hyphae in the filamentous fungus Neurospora crassa. Analyses by laser scanning confocal microscopy of strains expressing SEC-4 tagged with GFP at its C-terminal end showed that the C-terminal region has domains required for its proper localization. Contrary to what was observed in yeast, N. crassa with sec-4 (NCU01911.2) or sec-2 (NCU06404.2) deleted were both viable. However, the elimination of sec-2 (Δsec-2) does not affect the morphology or growth rate of hyphae during its in vegetative growth. In contrast, the elimination of sec-4 (TGasa-1) has adverse effects: 1) drastically reduced growth rate (3.0 μm min<sup>-1</sup>) compared to that of the control (FGSC # 9718; 23.0 μm min-1); 2) The tubular morphology of hyphae and behavior of the Spk were aberrant. Phase-contrast microscopy of N. crassa TGasa-1 hyphae showed variations in hyphal diameter, hyphal coils and an increase in the number of septa and branches. The Spk presented abrupt movements that resulted in sudden changes in direction of growth and consequently in deformation of the hyphal apex; the Spk had a smaller diameter (±0.49-1.25 µm) than in the control strain ((±0.86-1.6 µm). We also observed formation of septa near the apex (10-20 μm) in damaged hyphae, formation of abortive branches and an unusual branching pattern. In the distal parts of the hyphae accumulation of vacuoles and constricted areas were observed; 3) Exocyst assembly was impeded. Confocal microscopy analysis of progeny from crosses of N. crassa TGasa-1 with strains in which components of the exocyst complex SEC-5 and SEC-15 were tagged with GFP, demonstrated that SEC-4 is necessary for the proper assembly and localization of the exocyst, since the absence of SEC-4 resulted in mislocalized fluorescence of SEC-5-GFP and SEC-15-GFP. For these reasons, we propose that the role of SEC-4 in N. crassa is to participate in the process of recognition and fusion of vesicles with the plasma membrane in collaboration with the exocyst complex improving the efficiency exocytosis | |
| CICESE | |
| 2010 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| García Santiago, A.I.2010.La Rab GTPasa SEC-4 participa en la morfogénesis de hifas de Neurospora crassa.Tesis de Maestría en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California.88 pp. | |
| MICROBIOLOGÍA | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias |
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