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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/1315| Localización y función de enzimas involucradas en la remodelación de la pared celular de Neurospora crassa Localization and role of enzymes involved in Neurospora crassa cell wall remodeling. | |
| Leonora Elizabeth Martínez Núñez | |
| Meritxell Riquelme Pérez | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Neurospora crassa, Remodelación de la pared celular, Glucosil hidrolasa, BGT-1, BGT-2, MWG-1, GAS-5, CHIT-1 | |
| BGT-1 (NCU06381) y BGT-2 (NCU09175) son dos presuntas glucosil hidrolasas (GHs) en Neurospora crassa con presunta actividad glucosil transferasa y un dominio de unión a glucosil fosfatidil inositol (GPI), que les permite unirse a la membrana plasmática (MP) y permanecer en la pared celular de este hongo. Para discernir su papel en el desarrollo de N. crassa, BGT-1 y BGT-2 fueron etiquetadas con la proteína verde fluorescente (GFP) cuyo gen fue insertado directamente antes del sitio de unión a gpi en bgt-1 o después del péptido señal de bgt-2. BGT-1 y BGT-2 se observaron en la MP del domo apical, excluidas del Spitzenkörper (Spk) y de la MP frente a éste, donde anteriormente se han reportado quitina sintasas y β-1,3 glucano sintasas en N. crassa. Lo anterior sugiere una división espacial en las actividades durante el ensamblaje de la pared celular en el domo apical: en la punta, los glucanos son sintetizados en la MP apical por enzimas que se acumulan previamente en el Spk, mientras que en la base del domo apical, los glucanos son presumiblemente hidrolizados y entrecruzados, produciendo extremos libres para el entrecruzamiento con otros polímeros de la pared, como quitina. BGT-1 y BGT-2 fueron además observadas en el borde del septo en desarrollo, rodeando el poro septal, en las conexiones interconidiales, en los polos de los conidios liberados, en sitios de fusión de germínulas e hifas maduras y en sitios de ramificación; procesos que requieren presumiblemente remodelación de la pared celular. Adicionalmente se intentó etiquetar a las glucosil hidrolasas MWG-1 (NCU05974), GAS5 (NCU01162) y CHIT-1 (NCU02184) con mChFP siguiendo la estrategia usada para BGT-1-GFP, además de una estrategia de etiquetamiento mediante clonación in vivo en Saccharomyces cerevisiae para MWG-1. A pesar de haber obtenido colonias prototróficas en cada caso, ninguna de las cepas presentó fluorescencia que indicara su localización subcelular. El análisis de las cepas mutantes nulas simples y dobles reveló que las cepas bgt-2Δ y bgt-1Δ::bgt-2Δ son ligeramente resistentes a blanco de calcofluor (BC) y que bgt-1Δ::bgt-2Δ y chit-1Δ mostraron cierta resistencia a rojo congo (RC), lo que sugiere cambios en la arquitectura de la pared celular. Además, los defectos observados durante la conidiación en las cepas mutantes indican un papel significativo de BGT-1, BGT-2 y GAS-5 durante la remodelación de la pared celular del conidióforo para generar conidios. Neurospora crassa BGT-1 (NCU06381) and BGT-2 (NCU09175) are two putative glycoside hydrolases (GHs) with additional predicted glycosyltransferase activity and binding sites for a glycosyl phosphatidylinositol (GPI) anchor that would facilitate their attachment to the plasma membrane (PM). To elucidate their role in key morphogenetic events during vegetative development of N. crassa, BGT-1 and BGT-2 were labeled with the green fluorescent protein (GFP). The gfp was inserted immediately after the signal peptide sequence, within the bgt-2 encoding sequence, or directly before the GPIbinding site in the case of bgt-1. Both BGT-1-GFP and BGT-2-GFP were observed at the PM of the hyphal apical dome, excluding the foremost apical region and the Spitzenkörper (Spk), where chitin and β-1,3 glucan synthases have been previously found. These and previous studies suggest a division of labor of the cell wall synthesizing machinery at the hyphal dome: at the very tip, glucans are synthesized by enzymes that accumulate at the Spk, before gettig incorporated into the PM, whereas at the subtending zone below the apex, glucans are presumably hydrolyzed, producing amenable ends for further branching and crosslinking with other cell wall polymers. Additionally, BGT-1-GFP and BGT-2-GFP were observed at the leading edge of new developing septa, at unreleased interconidial junctions, at conidial poles, at germling and hyphal fusion sites, and at sites of branch emergence, all of them processes that seemingly involve cell wall remodeling. Furthermore, the strategy used for BGT-1 failed to fluorescently label the glycosyl hydrolases MWG-1 (NCU05974), GAS-5 (NCU01162) and CHIT-1 (NCU02184). Therefore, the Saccharomyces cerevisiae in vivo cloning system was tested to tag with mChFP MWG-1. Although many prototrophic transformants were obtained, no fluorescent strains were recovered. Single and double mutant strains for the corresponding genes showed that bgt-2Δ y bgt-1Δ::bgt-2Δ strains exhibited an increased resistance to the cell wall stressors calcofluor white (CW) and bgt-1Δ::bgt-2Δ and chit-1Δ strains were resistant to congo red (CR), which suggests they present significant architectural changes in their cell wall. Furthermore, the conidiation defects observed in the mutants indicate a significant role of BGT-1, BGT-2 and GAS-5 on the re-arrangement of glucans needed at the conidiophore cell wall to allow conidial separation and conidial production. | |
| CICESE | |
| 2016 | |
| Tesis de doctorado | |
| Español | |
| Martínez Núñez,L.E.2016.Localización y función de enzimas involucradas en la remodelación de la pared celular de Neurospora crassa. Tesis de Doctorado en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 61 pp. | |
| MICROBIOLOGÍA | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
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