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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/1397| Evaluación del método de reducción del cloruro de yodonitrotetrazolio (INT) a formazán para estimar la respiración de bacterias en comunidades marinas Evaluation of the method of reduction of iodonitrotetrazolium chloride (INT) to formazan to estimate the respiration of bacteria in marine communities | |
| MANET ESTEFANIA PEÑA SALINAS | |
| HELMUT MASKE RUBACH | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Procariontes marinos Reducción INT Comunidades marinas Marine prokaryotes INT reduction Marine communities | |
| Marine microbes are the group of organisms most abundant on our planet and it is estimated that microbial respiration in marine ecosystems corresponds to approximately half of the planktonic community respiration. The quantification of prokaryotic respiration is technically difficult due to the low volumetric rates and because there is little data about this process in the open ocean; the conventional method consists in monitoring oxygen consumption in bacterial samples for several days. The long incubation time promotes a change in the microbial community structure and the minimal change in O2 concentration implies a low signal to noise in the measurements of the respiration rates in the ocean. Here we evaluate the ETSvivo (electron transport system) method as an approximation of the prokaryotic respiration in marine samples. The ETSvivo method is based on the analysis of the enzymatic activity of respiratory electron transport located in the cell wall of prokaryotes where the oxygen is used as a final electron acceptor. The experimental tests were carried out with plankton samples collected in the Mexican Pacific at different depth; the samples were incubated with INT and the formazan [F, μmol L-1] production was quantified by absorbance measured with a spectrophotometer and an Ocean Optics fiber optic system. We found problems with the applicability of the method to estimate respiration rates [R, μmol L-1 h-1], and we tried to improve the method. The source of high blanks that decreased the intensity of formazan signal in oceanic samples and in prokaryote cultures was reduced by increasing the formalin concentration from 2 to 4%. The spectral form and the molar absorptivity coefficient of formazan for the spectrophotometer and for the Ocean Optics fiber optic system were determined to minimize the future use of standards. The interpretation of the simple formazan spectrum was improved by baseline correction. The protocol was optimized in terms of the pre-incubation size filtration of prokaryotes before incubating the samples with INT, replacing the 0.2 μm polycarbonate filter with membrane filter and performing the formazan extraction by the vortex type stirrer instead of the Beadbeater to avoid overestimation of the signal by the suspended particles. Still, after these different improvements we found no good relationship between F and R in natural plankton samples Los microbios marinos son el grupo de organismos más abundantes en nuestro planeta y se estima que la respiración microbiana en los ecosistemas marinos corresponde aproximadamente a la mitad de la respiración de la comunidad planctónica. La cuantificación de la respiración procariota es técnicamente difícil por las bajas tasas volumétricas y existen pocos datos sobre este proceso en el océano abierto; el método convencional consiste en el monitoreo del consumo de oxígeno en muestras bacterianas durante varios días. El tiempo largo de incubación promueve el cambio en la estructura de la comunidad microbiana y además el cambio mínimo en la concentración de O2 implica una baja señal sobre el ruido en las mediciones de las tasas de respiración en el océano. En este trabajo se presenta la evaluación del método ETSvivo (sistema de transporte de electrones por sus siglas en inglés) como aproximación a la cuantificación de la respiración procariota del ecosistema marino; el método corresponde al análisis de la actividad enzimática de las células que interviene en el mecanismo de transporte de electrones asociado a la pared celular de los procariotas, sitio en donde se utiliza al oxígeno como aceptor final de electrones y ocurre una consecuente producción de energía. Las pruebas experimentales se realizaron con muestras de una comunidad de plancton colectadas en el pacífico mexicano a diferente profundidad y disponibilidad de oxígeno, las cuales fueron incubadas con el cloruro de yodonitrotetrazolio (INT) y se cuantificó su reducción con la producción de formazán [F, μmol L-1] por medio de la medición de absorbancia con un espectrofotómetro y un sistema de fibra óptica Ocean Optics. Se encontraron aspectos técnicos y factores ambientales que intervienen en la aplicabilidad del método in situ para estimar las tasas de respiración [R, μmol L-1 h-1]. Se redujo la fuente de los blancos altos que disminuían la intensidad de la señal de formazán en muestras oceánicas y en cultivos de procariontes mediante el aumento de la concentración de formol de 2 a 4%. Se determinó la forma espectral y el coeficiente de absortividad molar del formazán para el espectrofotómetro y para el sistema de fibra óptica Ocean Optics para la interpretación de la señal de formazán a 485 nm. Se optimizó el protocolo en términos de realizar la filtración pre-incubación de los procariontes antes de someter las muestras con INT, reemplazar el filtro de policarbonato de 0.2 μm por filtro de membrana. | |
| CICESE | |
| 2017 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| Peña Salinas, M. E. 2017. Evaluación del método de reducción del cloruro de yodonitrotetrazolio (INT) a formazán para estimar la respiración de bacterias en comunidades marinas. Tesis de Maestría en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 62 pp | |
| METABOLISMO BACTERIANO | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ecología Marina |
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| 170608 Tesis INT Manet Peña FIN.pdf | Versión completa de la tesis | 2.87 MB | Adobe PDF | Visualizar/Abrir |