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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/2042| Diseño de nanopartículas con actividad citocromo P450 inmunológicamente inertes Design of nanoparticles with cytochrome P450 activity immunologically inerts | |
| KARLA PAULINA ALEJO GONZALEZ | |
| RAFAEL VAZQUEZ DUHALT | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Citocromo P450; CYP; Transformación de pesticidas; polietilenglicol; PEG Cytochrome, Pesticide transformation; Polyethylene glycol | |
| Con el fin de contar con un tratamiento enzimático para el envenenamiento por pesticidas se modificó químicamente, en dos pasos, a la mutante de la enzima citocromo P450 de Bacillus megaterium CYPBM3F87A obtenida por Cirino y Arnold en 2003. El primer paso consistió en incrementar los sitios disponibles para la unión de moléculas de PEG, a través de la adición de etilendiamina. Con esta modificación a la superficie de la enzima se observó un incremento en su capacidad de trasformar 2,6dimetoxifenol (DMF). El aumento en la actividad específica con DMF puede ser consecuencia de incremento en las interacciones catión p entre los grupos aminos libres y el sustrato aromático. En el segundo paso de la modificación química, el PEG 5000 se unió de manera covalente a residuos de aminoácidos con aminos primarios, como las lisina, y a los derivados de ácidos glutámicos y aspárticos previamente modificados con etilendiamina. El biocatalizador obtenido, CYPBM3F87A-PEG, no sólo conservó la capacidad de transformar DMF, diclorofeno, paratión, linurón, pentaclorofenol, clorpirifós, dinoterb, sino que mostró mayor velocidad de transformación de los pesticidas, siendo de 3 a 17 veces mayor la capacidad de trasformación de los sustratos. La CYPBM3F87A-PEG mostró mayor incremento en la velocidad de transformación del pesticida organoclorado clorpirifós, siendo 17 veces el incremento en la actividad con respecto a la CYPBM3F87A no modificada, seguido del diclorofeno y el paratión, ambos fueron transformados 9 veces más por la enzima modificada que por la no modificada. El incremento en la actividad específica de la enzima con los sustratos empleados se podría explicar, además, por el cambio en el microambiente, en el cual se incrementó la hidrofobicidad de la CYPBM3F87A y en los ligeros cambios en la estructura secundaria de la misma. La CYPBM3F87A-PEG fue capaz de catalizar la trasformación del DMF en un intervalo más amplio de pH que la enzima no modificada. Mientras que el pico máximo de actividad específica de la CYPBM3F87A fue a pH 8, el intervalo en el que la CYPBM3F87A-PEG transformó el DMF, por encima del 80%, fue de 8 a 11. Por otro lado el PEG permitió que la CYPBM3F87A transformara DMF después de ser incubada a temperaturas superiores a los 40°C sólo en los primeros minutos de incubación. La CYPBM3F87A-PEG transformó el pesticida organofosforado paratión en suero sanguíneo a temperatura ambiente con una eficiencia catalítica 2 veces mayor que en solución amortig With the aim to find an enzymatic treatment for pesticide poisoning, the mutant F87A of cytochrome P450 CYPBM3 from Bacillus megaterium, obtained by Cirino and Arnold in 2003, was modified by two chemical steps. In the first one, the carboxylic superficial residues were amined by the addition of ethilendiamine in order to increase the number free amino groups for the PEG modification. The catalytic activity of the amined CYPBM3F87A was enhanced showing higher transformation rate of 2,6-dimethoxyphenol (DMP), may be due to the augmentation in the cation-p interactions between amino and aromatic groups of the substrate. In the second step, the amined enzyme was chemically modified with PEG 5000 molecules that were covalently bind to amino free moieties of lysine, and glutamic and aspartic acid previously modified by ethilendiamine. The obtained CYPBM3F87A-PEG not only conserved catalytic activity using DMP, dichlorophen, parathion, linuron, pentachlorophenol, chlorpyrifos and dinoterb as substrate, but it actually showed elevated catalytic activity compared to unmodified CYPBM3F87A. The transformation of these substrates increased from 3 to 17 folds; whereas the specific activity was 17 times higher for organochlorine chlorpyrifos and 9 times higher for parathion and dichlorphen. This catalytic enhancement of modified CYPBM3F87A with PEG could be explained by the higher hydrophobicity and the slight modification of its secondary structure. CYPBM3F87A-PEG was able to catalyze DMP transformation in a wider pH range (8 to 11) than the unmodified enzyme, maintaining more than 80% of its specific activity while CYPBM3F87A showed the optimum activity at pH 8, possibly because PEG covered ionizable amino groups of the CYPBM3F87A. On the other hand, PEGylated CYPBM3F87A transformed DMP after incubation at more than 40°C only in the first few minutes. Nevertheless, the temperature profile remained similar for both enzymes. Moreover, CYPBM3F87A-PEG was able to transform parathion in blood serum with higher catalytic efficiency than in buffer MES, which represents an advantage for its use in therapeutic alternatives regarding pesticide intoxication in humans. Additionally, CYPBM3F87A-PEG was not recognized by macrophage-derived cells, indicating that the PEGylation avoided an immune response. The potential use of this biocatalytic preparation as treatment for pesticide poisoning is discussed. | |
| CICESE | |
| 2017 | |
| Tesis de doctorado | |
| Español | |
| Alejo González, K.P. 2017. Diseño de nanopartículas con actividad citocromo P450 inmunológicamente inertes. Tesis de Doctorado en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 53 pp. | |
| PROPIEDADES DE LOS MATERIALES | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Física de Materiales |
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| tesis_Alejo_González_Karla_Paulina_26_sep_2017.pdf | Versión completa de la tesis | 5.79 MB | Adobe PDF | Visualizar/Abrir |