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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/2175| Identificación molecular de Vibrio harveyi y el efecto de su virulencia en Litopenaeus vannamei Molecular identification of Vibrio harveyi and its virulent effect in Litopenaeus vannamei | |
| Galdy Hernández Zárate | |
| Jorge Olmos Soto | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Vibrio harveyi,Litopenaeus vannamei,Encimas | |
| Vibrio harveyi es una bacteria bioliminiscente, ubicua no solamente en ambientes marinos, sino que también es considerada como una de las principales especies bacterianas que forman parte de la flora normal de camarones saludables y de los sistemas de cultivo de estos organismos. Sin embargo, durante los últimos años, diferentes cepas de V. harveyi han emergido como agentes patógenos que generan tazas de mortalidad elevada y que afectan significativamente la acuicultura del camarón a nivel mundial. En Latinoamérica, incluyendo México, V. harveyi afecta drásticamente la producción de Litopenaeus vannamei, la especie cultivada en mayor proporción en estas áreas. Aun cuando existen diferentes estudios relacionados con las vibriosis en camarones peneidos, provocadas por V. harveyi, el mecanismo de patogenicidad de esta bacteria, aún en la actualidad es poco conocido. Asimismo, la plasticidad fenotípica y metabólica que caracteriza el género Vibrio ha ocasionado que los métodos tradicionales utilizados para la identificación y detención de V. harveyi resulten imprecisos y poco confiables. En este estudio, quince aislados del género Vibrio, provenientes de diferentes sistemas de cultivo de camarón, fueron sujetos a caracterización molecular mediante técnicas del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la amplificación al azar de fragmentos polimórficos de ADN (RADP). Asimismo, se generaron anticuerpos para la identificación específica de V. harveyi mediante la utilización de la técnica de despliegue de fragmentos de anticuerpos en bacteriófagos. Para la técnica de PCR se diseñaron oligonucleótidos dirigidos a diferentes genes de virulencia, reguladores transcripcionales o genes del sistema del quorum sensing de V. harveyi. Los oligonucleótidos diseñados para el gen luxN fueron especie-específicos e identificaron a ocho de los aislados como V. harveyi. El método RAPD generó perfiles cepa-específicos los cuales permitieron una clara diferenciación genética entre las cepas de V. harveyi, las cuales resultaron ser virulentas y no virulentas mediante bioensayos en juveniles de L. vannamei. Por otra parte, los fragmentos variables de cadena sencilla (FvCs) generados apartir de una biblioteca inmune de gallina, mostraron ser altamente específicos para la identificación de V. harveyi mediante ensayos tipo ELISA. Los ensayos de patogenicidad mostraron que dos aislados, cepas Z2 y Z3, fueron altamente virulentos causando 100% de mortalidad entre las 6-16 h posterior mente a la infección con 4.5 X 105 células de camarón-1, en comparación con la cepa control de V. harveyi ATCC 14126, la cual fue no virulenta a esta misma dosis. Las cepas M1 y Z1 causaron un 50% y 60% de mortalidad, respectivamente. Se determinó que los aislados de V. harveyi produjeron in vitro diferente tipos de moléculas biológicamente activas en sus PECs (productos extracelulares), principalmente proteasas y hemolisinas. Los PECs, así como la cepa misma, mostraron una actividad citotoxíca fuerte en hemocitos de camarón, con una disminución del 76% en el nuero de hemocitos a los 30 min post-infección. Mediante hibridación FISH (hibridación fluorescente in situ) se evidencio que gran parte de la población bacteriana inoculada en los camarones, en estados fisiológicos “tempranos” (densidad óptica de 2), entra en un estado de viable no cultivable en la hemolinfa, sufriendo cambios morfológicos y una reducción celular a los 15 min post-infección. La cepa Z3 y sus PECs afectaron las propiedades de coagulación de la hemolinfa, la recuperación en el número de hemocitos y finalmente facilitaron una septicemia generalizada en los organismos infectados. Los resultados obtenidos indican que los métodos basados en el uso del PCR y del RAPD, son rápidos y simples, por lo que constituyen una herramienta útil en la identificación y diferenciación de cepas de V. harveyi. Además, las propiedades hemolíticas y proteolíticas de las cepas V. harveyi y de sus PECs sugieren que están involucradas en la patogénesis de algunos de los aislados de V. harveyi como Z3. Vibrio harveyi, a bioluminiscent bacterium, is not only ubiquitous in the marine environment but is also considered done of the principal bacteria species that form part of the normal flora of healthy shrimps in the culture systems of these organisms. However, over the last year, strains of these species have been recognized as significant pathogenic agents and a cause of high rates of mortality in shrimp cultured worldwide. In LatinAmerica, included Mexico, V. harveyi drastically affects the production of Litopenaeus vannamei, the most extensively cultured penaeid in these areas. There are several reports related with vibriosis in peneid shrimps, caused by V. harveyi, but the pathogenicity mechanism of this bacterium is little known yet. Likewise, phenotypic and metabolic plasticity characteristic of Vibrio genus have caused that traditional methods for V. harveyi identification and detection are imprecise and uncertain. In this study, fifteen Vibrio isolates, from different shrimp culture system, have been subject to molecular characterization using different molecular techniques likes RFLP (restriction fragment length polymorphism), PCR (polymerase chain reaction) and RAPD (random amplified polymorphic DNA). As well, monoclonal antibodies were generated for specific identification of V. harveyi by means of a phage display system. For PCR, primers targeted to different virulent, transcriptional regulators, or quorum sensing genes from V. harveyi, were designed. Primers designed for luxN were species-specific and identified eight isolates as V. harveyi. RAPD method generated strain-specific fingerprints allowing. Genetic distinction between Vibrio spp. Strains and V. harveyi. Results with this technique also showed a clear genetic differentiation between strains of V. harveyi, which proved to be virulent and avirulent strains by means of bioassays in L. vannamei juveniles. Singles-chain Fragments variable (scFv) generated from a chicken library, permitted the recognition of V. harveyi strains using ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays) but not those from other species within them V. harveyi which form a core group of closely related vibrios (V. alginolyticus, V. parahaemolyticus and V. campbellii). Concerning virulence assays, a decrease in activity accompanied by cessation of feeding and swim was observed for shrimp inoculated with live cells of the control strain (V. harveyi ATCC 14126) but there was no mortality from this treatment when doses of 4 X 105 cell shrimp-1 were used. In contrast, Z2 and Z3 isolates were found to be highly virulent and had 100% mortality using the same concentrations of cells. Mortality was observed within 6-16h post-injection with an LD50 of 1.32 X 105 cells srimp-1 for both strains. Experiments done with Z2 needed twice the time produce the same effect showed by the Z3 strain. M1 and Z1 strains produced 50% and 60% mortality, respectively. V harveyi isolates produced different biologically active molecules in their ECPs (extracellular products), mainly proteases and haemolysins, which probably are involved in the virulence mechanisms of this bacterium. Chemical composition of the media influenced the production of virulent factors in the strains. Z3 strain showed a strong cytotoxic activity towards shrimp haemocytes in vivo, after 15 min post-injection; as well as ECPs produced in vitro by this strain showed to contain once or several heat-inactivated virulence factors. The virulence factors, probably of proteinaceous nature, caused also a strong lytic effect towards shrimp haemocytes with a significative decrease about 76% after 30 min post-injection. A saline solution of phosphates (PBS) increased about 200% the number of haemocytes in circulation. By means of FISH hybridization (fluorescent in situ hybridization), it was observed that a large portion of bacterial population in “early” physiological states (optical density 2) enter in a viable but nonculturable state in the haemolymph, with morphologic changes and reduction in cell size after 15 min postinfeccion. Z3 strain and its ECPs affected the haemolymph coagulation properties, the recuperation in the haemocytes number and finally, facilitated a general septicemia in infected organisms. Nevertheless, even though that level of pathogenicity generally depends of the PECs properties, it is important to consider that they do not constitute the only virulent factor present in bacterial, moreover it is also commonly consider that bacterial pathogenicity is a synergistic interaction between different virulence factors. The obtained results indicated that RAPD-based methods are fast, simple and specific, and thus may be a helpful tool in the identification and differentiation of V.harveyi strains. In addition, the proteolytic and heamolytic properties of the V. harveyi strains and from their ECPs secreted into extracellular space, suggest that they are involucrated in the pathogenesis from some isolates as Z3 strain. | |
| CICESE | |
| 2005 | |
| Tesis de doctorado | |
| Español | |
| Hernández Zárate, Galdy.2005.Identificación molecular de Vibrio harveyi y el efecto de su virulencia en Litopenaeus vannamei.Tesis de Maestría en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California.xi,215 hojas | |
| MICROBIOLOGÍA | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias |
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