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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/2816| El papel del extremo carboxilo terminal de SEC-10 en el ensamble del exocisto en Neurospora crassa The role of the carboxy terminus of SEC-10 in exocyst assembly in Neurospora crassa | |
| ALFREDO FIGUEROA MELENDEZ | |
| MERITXELL RIQUELME PEREZ | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Exocisto, exocitosis, GFP, Neurospora crassa, SEC-10 Exocyst, exocytosis, GFP, Neurospora crassa, SEC-10 | |
| El exocisto es un complejo octamérico evolutivamente conservado que se encarga de anclar vesículas secretoras a la membrana plasmática diana previo a su fusión. Mutaciones en las subunidades de este complejo resulta en efectos severos en la exocitosis y causa una acumulación irregular de macrovesículas en el subápice de hifas de Neurospora crassa. Las subunidades del exocisto se localizan en el domo apical de las hifas, algunas muy cercanas a la membrana plasmática (SEC-3, SEC-5, SEC-6, SEC-8, SEC-10 y SEC-15) y otras en la periferia frontal del Spitzenkörper (SEC-3, EXO-70 y EXO-84). En Magnaporthe oryzae el etiquetamiento endógeno de SEC-10 con GFP no ha sido exitoso y en N. crassa la adición de una etiqueta GFP en el extremo carboxilo terminal resulta en una cepa de fenotipo aberrante, lo que sugiere que la GFP representa un impedimento en el ensamble del exocisto. En este estudio se analizaron las secuencias de las subunidades del exocisto de N. crassa en distintos servidores y se identificaron motivos y dominios que no habían sido aún reportados. Se detectó un dominio de unión a fosfatifilinositol 4,5-bifosfato en SEC-3, un motivo de unión a calcio en SEC-8 y dominios ´repeat-like´ de culina en EXO-70 y EXO-84. Con estos resultados se sugiere que el exocisto puede ser regulado por calcio, ubiquitina y contiene dominios que interactúan con membranas. Se generaron modelados tridimensionales en SWISS-Model a partir de las secuencias de aminoácidos de las subunidades y se realizó una búsqueda de los motivos CorEx de S. cerevisiae en la estructura predicha de las proteínas del exocisto. Los motivos CorEx solamente fueron detectados en SEC-3, SEC-8 y SEC-10. Se sometieron los modelos tridimensionales bajo simulaciones de acoplamiento molecular en el servidor ClusPro por pares. En la simulación las subunidades del exocisto se acoplaron entre sí en el haz de hélices que está en el extremo N-terminal de cada subunidad justo después de la cola N-terminal característico de estas proteínas. La orientación invertida de SEC-10 vista en el acoplamiento molecular con SEC-15 sugiere que al igual que en S. cerevisiae SEC-10 pudiera estar orientado hacia el centro del complejo. Sin embargo, en este estudio se reveló que, aunque el haz de hélices N-terminal de SEC-10 se acopla con el haz de hélices N-terminal de SEC-15 ambos extremos C-terminal se orientan en sentidos opuestos. Se etiquetó el extremo N-terminal de SEC-10 con GFP y no hubo efectos severos en el ... The exocyst is a highly conserved octameric protein complex known to tether secretory vesicles to the plasma membrane before the fusion between the two membranes. Mutations in some of the subunits result in severe defects in exocytosis and cause an irregular accumulation of macrovesicles in the subapical region of Neurospora crassa hyphae. In N. crassa some subunits localize at the apical dome of hyphal tips near the plasma membrane (SEC-3, -5, -6, -8 and SEC-15), while others occupy the frontal outer layer of the Spitzenkörper (SEC-3, EXO-70 and EXO-84). Previous attempts to, C-terminally tag SEC-10 with GFP in N. crassa allowed localization of this subunit at the hyphal apical plasma membrane, but cells presented an aberrant phenotype, and growth defects, which suggests that the GFP tag represents an impediment to the exocyst assembly. In this study, we analyzed the sequences of N. crassa exocyst subunits in different servers and identified domains and motifs that have not been previously reported. A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate binding domain was detected in SEC-3, a calcium binding motif in SEC-8 and ´repeat-like´ cullin domains in EXO-70 and EXO-84. These results suggest that the exocyst can be regulated by calcium, ubiquitin and contains domains that interact with membranes. The amino acid sequences of the subunits were used to generate three-dimensional models in SWISS-Model. A search of the CorEx motifs of S. cerevisiae was performed in the predicted structure of the modeled exocyst proteins. CorEx motifs were only detected in SEC-3, SEC-8 and SEC-10. Three-dimensional models were submitted under molecular docking simulations on the ClusPro server. In the simulation, the exocyst subunit pairs dock with each other via the N-terminal helical bundles just after the characteristic N-terminal tail of these proteins. However, we reveal in this study that although the N-terminal helical bundle of SEC-10 docks with the N-terminal helical bundle of SEC-15 both C-terminal ends were oriented in opposite directions. The inverted orientation of SEC-10 seen in the molecular docking with SEC-15 suggests that as in S. cerevisiae SEC-10 could be oriented towards the center of the complex. The N-terminal end of SEC-10 was tagged with GFP and unlike for the C-terminally tagged version, there were no hyphal growth defects observed in the corresponding hyphae. Elimination of sec-10 caused an aberrant phenotype with slow growth and poor conidiation in ... | |
| CICESE | |
| 2019 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| Figueroa Meléndez, A. 2019. El papel del extremo carboxilo terminal de SEC-10 en el ensamble del exocisto en Neurospora crassa. Tesis de Maestría en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 67 pp. | |
| BIOLOGÍA MOLECULAR DE MICROORGANISMOS | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
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