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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/3212| Caracterización enzimática de la agmatinasa de Neurospora crassa y su relación con el citoesqueleto de actina Structural characterization of agmatinase from Neurospora crassa and its relationship with the actin cytoskeleton | |
| LUIS LEOBARDO PEREZ MOZQUEDA | |
| ERNESTINA CASTRO LONGORIA | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Agmatina, Poliaminas, Agmatina ureohidrolasa, Urea, Hongos agmatine, polyamines, agmatine ureohydrolase, urea, fungi | |
| La agmatinasa es una metaloenzima que usa agmatina para producir putrescina y urea, en bacterias, plantas y mamíferos participa en la ruta alterna para la síntesis de poliaminas. Sin embargo, en hongos filamentosos como Neurospora crassa su función no es del todo clara, por lo que el objetivo principal de este trabajo es elucidar la relación entre la agmatinasa (AGM-1) y el citoesqueleto de actina y proveer una caracterización enzimática de dicha proteína. Para lograr este objetivo, se comparó la localización de la proteína AGM-1 con proteínas de unión a actina (FIM-1 y TPM-1), también se analizó la localización de la proteína AGM-1 en presencia de inhibidores de la polimerización de actina, así como ensayos de polimerización y despolimerización de filamentos de actina en presencia y ausencia de agmatina y agmatinasa. Además, se realizó una mutación puntual en el sitio de unión al sustrato, con la finalidad de corroborar que la localización intracelular se debe a la unión con la agmatina. Por otra parte, se realizó una caracterización enzimática de la proteína AGM-1 de N.crassa, en la cual se evaluó la presencia de cofactores (MnCl2), perfil de pH, la termoestabilidad, el y parámetros cinéticos (Km, Vmax y kcat). Los resultados mostraron que la proteína AGM-1 colocaliza con las proteínas de unión a actina FIM-1 y TPM-1 y que su localización se ve afectada principalmente por latrunculina B un inhibidor de los filamentos de actina, aunque también se afecta por el inhibidor de los microtúbulos, en menor medida. Además, se demostró que la AGM-1 puede despolimerizar los filamentos de actina (in vitro) cuando son polimerizados con ayuda de la agmatina y que la proteína AGM-1 se deslocaliza cuando se modifica el sitio de unión al sustrato. Por otra parte, se observó que la actividad enzimática de la proteína AGM-1 decae cuando se usa EDTA. Mediante la curva de temporalidad se determinó que la actividad especifica fue de 1.5 U/mg. También se observó que el pH óptimo está en el rango de 8 a 8.5. Con respecto a la termoestabilidad se observó que la proteína pierde su capacidad catalítica hasta en un 80% a 70°C por 15 min. AGM-1 tuvo una Km de 105 x10-6 M. La kcat calculada fue de 0.029 s-1 y se obtuvo una eficacia catalítica (kcat/Km) de 2.7x102 s-1 M-1. Los resultados presentados sugieren que la AGM-1 tiene un papel importante en la polimerización de los filamentos de actina, y que se requiere que el sitio de unión al sustrato este intacto para que pueda haber ... The agmatinase is a metalloenzyme that uses agmatine to produce putrescine and urea; in bacteria, plants, and mammals the agmatinase participates in the alternative route for the synthesis of polyamines. However, in fungi such as N. crassa, its function is still not clear. Therefore, the main objective of this work is to elucidate the relationship between the agmatinase (AGM-1) and the actin cytoskeleton and provide an enzymatic characterization of the AGM-1. To achieve this goal, we compared the localization of the protein AGM-1 with actin-binding proteins (FIM-1 and TPM-1), we also analyzed the localization of the protein AGM-1 in the presence of actin filamentation inhibitors, as well as polymerization and depolymerization essays of actin filaments, in the presence and absence of agmatine and agmatinase. Also, a site-specific mutation in the binding site of the enzyme to the substrate was performed, to corroborate that intracellular localization is due to the binding with the agmatine. On the other hand, a characterization of the enzyme AGM-1 was carried out; the following parameters were assessed: the presence of cofactors (MnCl2), pH profile, thermostability, and kinetic parameters (Km, Vmax, and kcat). The results showed that the protein AGM-1 colocalizes with the actin-binding proteins FIM-1 and TPM-1 and its localization was affected mainly by the inhibitor of actin filaments, although it is also affected by the inhibitor of microtubules, to a lesser extent. In addition, we demonstrated that AGM-1 can depolymerize actin filaments (in vitro) when they are polymerized with the aid of agmatine, and that the protein AGM-1 is delocalized when the binding site to the substrate is changed. On the other hand, it was observed that the enzymatic activity of the protein AGM-1 decays when using EDTA in the reaction mixture, and by using the curve of temporality the specific activity was determined, which was 1.5 U/mg. It was also observed that the optimal pH is in the range of 8 to 8.5, and with respect to the thermal stability it was found that the protein loses its catalytic ability, up to 80% at 70° C for 15 min. The kinetic parameters observed were a Km of 105 x10-6 M. The kcat calculated was of 0.029 s-1 and was obtained a catalytic efficiency (kcat/Km) of 2.7x102 s-1 M-1. The obtained results here strongly suggest that the AGM-1 plays an important role in the polymerization of actin filaments, and that the binding site to the substrate is required to ... | |
| CICESE | |
| 2020 | |
| Tesis de doctorado | |
| Español | |
| Pérez Mozqueda, L.L. 2020. Caracterización enzimática de la agmatinasa de Neurospora crassa y su relación con el citoesqueleto de actina. Tesis de Doctorado en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 49 pp. | |
| HONGOS | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
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