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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/3239| Diseño de nanorreactores con actividad citocromo P450 activados con glucosa oxidasa Design of nanoreactors with cytochrome P450 activity activated by glucose oxidase | |
| OSCAR GONZALEZ DAVIS | |
| Rafael Vázquez Duhalt | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| nanorreactor, citocromo P450, reacción enzimática, partículas tipo virus, glucosa oxidasa nanoreactor, cytochrome P450, enzymatic reaction, virus-like particles, glucose oxidase | |
| En el presente trabajo se diseñaron y evaluaron cuatro estrategias para producir nanorreactores con actividad citocromo P450 activados por la enzima glucosa oxidasa (GOx) proveniente de Aspergillus niger. En primer instancia se trabajó con co-encapsidar ambas enzimas dentro de partículas tipo virus (VLPs) del virus del moteado clorótico del frijol caupí (CCMV). La segunda estrategia consistió en funcionalizar la superficie de partículas inorgánicas de ZnO y TiO2. Así mismo, se trabajó en la producción de una proteína de fusión a partir de la amplificación por PCR del gen que codifica para la GOx así como el dominio hemo del citocromo P450 de Bacillus megaterium, CYPBM321B3. Finalmente, la estrategia con mejores resultados consistió en encapsidar al CYPBM321B3 dentro de VLPs a partir de las cápsides del bacteriófago P22. Los nanorreactores producidos fueron funcionalizados sobre la superficie externa con la enzima glucosa oxidasa para que en presencia de glucosa se generara peróxido de hidrógeno necesario para llevar a cabo la activación del citocromo. Se realizó una caracterización cinética de los nanorreactores utilizando 2,6-dimetoxifenol en combinación con glucosa como sustratos, así mismo, las VLPs fueron caracterizadas mediante microscopía electrónica de transmisión en donde fue posible observar la conjugación de la GOx sobre la superficie de los nanorreactores. Por último, como prueba de concepto se evaluó la capacidad de transformación de los disruptores endocrinos bisfenol A, nonilfenol, 17β-estradiol, triclosano y resorcinol por efecto del CYPBM321B3 mediante cromatografía líquida de alta presión y los productos de transformación fueron identificados mediante espectrometría de masas. La capacidad de transformación de compuestos estructuralmente diversos, fácil producción y disponibilidad de sustrato en el organismo hacen de estos reactores una plataforma interesante para la entrega enzimática dirigida en aplicaciones terapéuticas. Adicionalmente, los resultados obtenidos han dado pauta a continuar con líneas de investigación enfocadas a la activación de profármacos utilizados en la terapia contra el cáncer de mama. This work comprises the design and evaluation of four strategies for the production of nanoreactors with cytochrome P450 activity activated by the enzyme glucose oxidase (GOx) from Aspergillus niger. The first strategy tested consisted of co-encapsidation of cytochrome P450 and GOx inside virus-like particles (VLPs) from the cowpea chlorotic mottle virus (CCMV). The second strategy consisted in the functionalization of zinc oxide as well as titanium dioxide nanoparticles with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and attached both enzymes on their surface. Another strategy evaluated was the production of a fusion protein based on the cloning of the genes codifying for GOx as well as the heme domain of the cytochrome P450 from Bacillus megaterium, CYPBM321B3. Finally, the best results were obtained when CYPBM321B3 was encapsidated inside VLPs from the bacteriophage P22 and functionalized with GOx on the external surface of the nanoreactors in order to generate the hydrogen peroxide necessary to activate the cytochrome. Enzyme kinetics based on the Michaelis-Menten equation were established using 2,6-dimethoxyphenol and glucose as substrates. Additionally, the VLPs were characterized by electronic transmission microscopy which allowed us to identify individual GOx molecules conjugated on the surface of the reactors. Lastly, as a proof of concept, the capacity of CYPBM321B3 to transform the endocrine disruptors bisphenol A, nonylphenol, 17β-estradiol, triclosan and resorcinol was evaluated by high pressure liquid chromatography (HPLC) and the transformation products were identified by mass spectrometry. The capacity to transform structurally diverse compounds, ease of production and substrate availability make these reactors an interesting platform for directed delivery of enzymes in therapeutic applications. The results obtained in this work have allowed us to explore different research lines mainly focused on the localized activation of prodrugs used in breast cancer therapies. | |
| CICESE | |
| 2020 | |
| Tesis de doctorado | |
| Español | |
| González-Davis, O. 2020. Diseño de nanorreactores con actividad citocromo P450 activados con glucosa oxidasa. Tesis de Doctorado en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 73 pp. | |
| ENZIMOLOGIA | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
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| Tesis González Davis Oscar_10_marzo_2020.pdf | Versión completa de la tesis | 2.58 MB | Adobe PDF | Visualizar/Abrir |