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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/3528| Evaluación de la capacidad neutralizante de TNFα por una proteína quimérica diseñada in silico a partir de un VNAR Evaluation of the neutralizing capacity of TNFα by a chimeric protein designed in silico from a VNAR | |
| Monserrat Rentería Maciel | |
| Alexei Licea Navarro | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Fibronectina humana, Humanización de anticuerpos, Factor de necrosis tumoral α, Andamio, Heterodontus francisci Human fibronectin, Antibody humanization, Tumor necrosis factor α, Scaffolding, Heterodontus francisci | |
| Los tratamientos anti-TNFα actuales presentan variados efectos secundarios y en algunos casos resultan ineficientes ya que se desarrolla tolerancia. En la búsqueda de tratamientos que no generen reacciones de inmunidad ni efectos secundarios, el equipo de trabajo en el que se inserta esta tesis ha desarrollado in silico una proteína quimérica (F_T16) usando por primera vez a FN (dominio 15 del módulo III de la fibronectina humana) como andamio para el CDR3 de un VNAR anti-TNFα. Los dominios del módulo III de la fibronectina humana son del tamaño de una miniproteína, y a pesar de no tener enlaces disulfuro presentan una estructura terciaria similar a un VNAR. Durante el análisis in silico de interacción con TNFα, F_T16 ha mostrado mayor reconocimiento que su VNAR parental, esto necesita comprobarse mediante ensayos in vitro e in vivo. Esta tesis presenta ensayos in vitro para comprobar los resultados obtenidos in silico. Para esto se plantearon tres objetivos: 1. Obtener la proteína recombinante F_T16. 2. Evaluar la capacidad de reconocimiento de la proteína quimérica por TNFα. 3. Comprobar la capacidad de la proteína quimérica para neutralizar TNFα. La obtención de los plásmidos recombinantes se logró mediante el robustecimiento del protocolo de ligación, las proteínas FN y F_T16 se obtuvieron marcadas con la para su purificación e identificación. Para determinar la capacidad de reconocimiento: se realizó un ELISA utilizando un anticuerpo anti-HA, sin encontrar coincidencia con los resultados in silico; en consecuencia, se solicitó un ensayo in silico adicional con un modelo de F_T16 que considerara las etiquetas HA y 6xHis; mostrando reconocimiento de TNFα por la etiqueta HA de F_T16 y se corroboró mediante un ELISA utilizando un anticuerpo anti-6xHis. Sin embargo, la comprobación de la capacidad neutralizante no pudo completarse por restricciones de tiempo impuestas por la condición sanitaria actual. Futuros estudios deberán profundizar nuestros resultados para conocer si las regiones de TNFα a las que se une la etiqueta HA son las mismas a las que se une su receptor y, si lo anterior fuera positivo, corroborar la neutralización mediante un ensayo in vivo en células L929. Current anti-TNFα treatments have various side effects and in some cases are inefficient as tolerance develops. In the search for treatments that do not generate immunity reactions or side effects, the team in which this thesis is inserted has developed in silico a chimeric protein (F_T16) using for the first time FN (module III domain 15 of human fibronectin) as scaffolding for the CDR3 of an anti-TNFα VNAR. Module III domains of human fibronectin are the size of a mini-protein, and despite not having disulfide bonds they have a tertiary structure similar to a VNAR. During the in silico analysis of interaction with TNFα, F_T16 has shown greater recognition than its parental VNAR, this needs to be verified by in vitro and in vivo assays. This thesis presents in vitro tests to check the results obtained in silico. Three objectives were set: 1. Obtain the recombinant protein F_T16. 2. Evaluate the recognition capacity of the chimeric protein by TNFα 3. Check the ability of the chimeric protein to neutralize TNFα. The recombinant plasmids were obtained by strengthening the ligation protocol, the FN and F_T16 proteins were marked with the hemagglutinin labels (HA) and six histidines (6xHis) for purification and identification. To determine the recognition capacity: a ELISA was performed using an anti-HA antibody, without finding a match with the in silico results; consequently, an additional in silico assay with an F_T16 model was requested that considered the HA and 6xHis labels; showing TNFα recognition by the HA label of F_T16 and corroborated by an ELISA using an anti-6xHis antibody. However, the verification of neutralizing capacity could not be completed due to time constraints imposed by the current health condition. Future studies should deepen our results to know if the regions of TNFα to which the HA label is attached are the same to which its receptor is attached and, if this is positive, corroborate the neutralization by an in vivo assay in L929 cells. | |
| CICESE | |
| 2021 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| Rentería Maciel, M. 2021. Evaluación de la capacidad neutralizante de TNFα por una proteína quimérica diseñada in silico a partir de un VNAR. Tesis de Maestría en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 66 pp. | |
| OTRAS | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
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