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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/3571| Generación y caracterización de tres bibliotecas sintéticas de anticuerpos basadas en tres marcos de anticuerpos vNAR Generation and characterization of three synthetic antibody libraries based on three vNAR antibody frameworks | |
| OLIVIA CABANILLAS BERNAL | |
| Alexei Fedorovish Licea Navarro | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Anticuerpos, vNAR, anticuerpos de dominio sencillo, bibliotecas sintéticas, VEGF, angiogénesis Antibodies, vNAR, single domain antibodies, synthetic libraries, VEGF, angiogenesis | |
| Los fragmentos de anticuerpos de dominio sencillo vNAR, derivados de tiburones, presentan características especiales en comparación con las moléculas convencionales de anticuerpos, como tamaño pequeño (12-15 kDa), estabilidad térmica y química y buena penetración tisular, entre otras. Estas carácterísticas los vuelven una buena fuente alternativa de agentes terapéuticos o de diagnóstico. Por lo tanto, es esencial mejorar las técnicas utilizadas para el desarrollo y la selección de fragmentos vNAR que reconozcan y neutralicen a distintos antígenos. El desarrollo de bibliotecas sintéticas de fragmentos de anticuerpos, ofrece una opción rápida para la generación de anticuerpos con las características deseadas. En este trabajo se construyeron tres bibliotecas sintéticas de vNAR, nombradas VS0, VS1 y VS2, utilizando marcos de anticuerpos vNAR sin cisteínas, con una cisteína y con dos residuos de cisteínas dentro de su CDR3, respectivamente, con el objetivo de determinar si la presencia o ausencia de cisteínas en la CDR3 favorece el aislamiento de clonas vNAR de una biblioteca sintética. Las bibliotecas VS0, VS1 y VS2 presentaron tamaños de 1.2x109, 4.0x109 y 3.4x1011 transformantes en total, respectivamente. Las bibliotecas se validaron realizando una selección contra seis proteínas de mamíferos (AQP1, VEGF, FGF-2, LIF, GYPA y CEA) y eritrocitos de gallina. Se obtuvo al menos un anticuerpo contra cada uno de los antígenos, y se aisló una clona contra todos los antígenos a partir de la selección con la biblioteca sin cisteína en su CDR3. Se evaluó la funcionalidad de los anticuerpos seleccionados contra VEGF y CEA. Dos anticuerpos aislados contra VEGF (VS1-20 y VS0-4) fueron capaces de inhibir la angiogénesis in vitro en un modelo tridimensional de células endoteliales. En conclusión, nuestros resultados sugieren que durante la construcción de bibliotecas sintéticas el uso de marcos vNAR sin cisteínas en el CDR3 podría incrementar el aislamiento de anticuerpos funcionales de las bibliotecas y que tener un gran número de transformantes no garantiza el éxito de la biblioteca, como se obsercó con VS2. Además, los resultados de los ensayos de angiogénesis in vitro y análisis in silico con los anticuerpos anti-VEGF sugieren que los anticuerpos aislados de bibliotecas sintéticas pueden rivalizar a los anticuerpos aislados de bibliotecas inmunes naturales e incluso a los anticuerpos cuya afinidad ha sido mejorada a través de modelado in silico. Single domain antibodies derived from sharks, vNAR, present special characteristics in comparison to the conventional antibody molecules such as: small size (12-15 kDa), thermal and chemical stability and great tissue penetration, among other. These characteristics make them a good alternative source as therapeutic or diagnostic agents. Therefore, it is essential to improve techniques used for the development and selection of vNAR antibodies that recognize distinct antigens. The development of synthetic antibody libraries offers a fast option for the generation of antibodies with the desired characteristics. In this work three synthetic antibody libraries were constructed, named VS0, VS1 and VS2, using vNAR antibody frameworks without cysteines, with one cysteine and with two cysteine residues within its CDR3, with the objective of determining whether the presence or absence of cysteines in the CDR3 favors the isolation of vNAR clones from a synthetic library. The libraries VS0, VS1 and VS2 presented sizes of 1.2x109 , 4.0x109 y 3.4x1011 transformants altogether, respectively. The libraries were validated selecting against six mammal proteins (AQP1, VEGF, FGF-2, LIF, GYPA and CEA ) and chicken erythrocytes. At least one vNAR was found for each of the antigens, and a clone coming from the library without cysteine in the CDR3 was selected with all the antigens. The functionality of the selected antibodies against VEGF and CEA was evaluated. Two antibodies isolated against VEGF (VS1-20 and VS0-4) were able to inhibit in vitro angiogenesis in a three-dimensional model of endothelial cells. An antibody selected against CEA, named CV0-43, was able to recognize soluble CEA and CEA on the surface of HCT-116 colorectal carcinoma cells, when was tested by flow cytometry. In conclusion, our results suggest that the use of vNAR frameworks without Cys residues could increase the isolation of functional antibodies within the synthetic libraries and that having a large number of transformants does not ensure the success of the library as our results show with VS2 library. In addition, the results of in vitro angiogenesis assays and in silico analysis of anti-VEGF antibodies suggest that antibodies isolated from synthetic libraries can rival antibodies whose affinity has been improved through in silico modeling. | |
| CICESE | |
| 2019 | |
| Tesis de doctorado | |
| Español | |
| Cabanillas Bernal, O. 2019. Generación y caracterización de tres bibliotecas sintéticas de anticuerpos basadas en tres marcos de anticuerpos vNAR. Tesis de Doctorado en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 94 pp. | |
| OTRAS | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
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