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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/3642| Producción de bionanorreactores mitodirigidos con actividad timidina fosforilasa para el potencial tratamiento del síndrome de encefalomiopatía neurogastrointestinal mitocondrial (MNGIE) Mitocondria-targeted bionanoreactors containing thymidine phosphorylase activity for the potential treatment of mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy syndrome (MNGIE) | |
| Angélica Hernández González | |
| Rafael Vázquez Duhalt | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Nanorreactores, partículas tipo virus, timidina fosforilasa, MNGIE | |
| En el presente trabajo se produjeron nanorreactores enzimáticos conteniendo a la enzima timidina fosforilasa (TP) en partículas tipo virus (VLPs) derivadas del virus del mosaico del bromo (BMV). La enzima fue funcionalizada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) con el doble propósito de mejorar su carga superficial y monitorear la localización mitocondrial (mitodirección) de las cápsides por microscopía confocal. La encapsidación enzimática se realizó mediante una reacción de autoensamble en diálisis utilizando la proporción molar 3.6:1 de enzima modificada (TP-FITC) por proteína de cápside (CP). Los nanorreactores fueron purificados por ultracentrifugación y caracterizados mediante espectroscopía de dispersión dinámica de luz (DLS) y microscopía electrónica de transmisión (TEM). Se sintetizó el compuesto bromuro de (2 carboxietil)trifenilfosfonio (2CETPP) para la funcionalización de los nanorreactores con el fin de dirigirlos a mitocondrias en cultivos celulares de hepatocitos murinos AML-12. El compuesto sólido resultante fue purificado y caracterizado mediante espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR), cromatografía líquida de alta resolución (LC-MS) y espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN). Finalmente, se llevó a cabo un ensayo de mitodirección in vitro utilizando 1.3 x 107 nanorreactores (TPFITC-BMVTPP) por célula. Las mitocondrias fueron marcadas con Mito-ID Red y la co-localización de las señales de FITC y Mito-ID fue observada a través de microscopía confocal determinando el porcentaje de correlación comparado con nanorreactores sin funcionalizar. The focus of this work was the production of enzymatic nanoreactors containing the enzyme thymidine phosphorylase (TP) inside virus-like particles (VLPs) derived from the brome mosaic virus (BMV). We report the enzymatic functionalization using fluorescein isothiocyanate (FITC) with a dual purpose: improve the negative surface charge of TP, and monitoring the mitochondrial localization (mitodirection) of the capsids by confocal microscopy. Enzyme encapsidation was carried out by a self-assembly reaction in dialysis using the 3.6: 1 molar ratio of functionalized enzyme (TPFITC) per capsid protein (CP) respectively. Once assembled, nanoreactors were purified by ultracentrifugation and characterized by dynamic light scattering spectroscopy (DLS) and transmission electron microscopy (TEM). We describe the synthesis of (2-carboxyethyl) triphenylphosphonium bromide (2CETPP) to functionalize nanoreactors and direct them to mitochondria. The resulting solid compound was purified and analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), high-performance liquid chromatography (LC-MS), and nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR). Finally, an in vitro mitochondrial targeting assay was carried out using the murine hepatocytes AML-12 cell line with 1.3 x 107 nanoreactors (TPFITC-BMV-TPP) per cell. Mitochondria were marked with Mito-ID Red and colocalization of the FITC and Mito-ID signals was observed through confocal microscopy, obtaining a high correlation percentage when compared with the non-functionalized nanoreactors. | |
| CICESE | |
| 2021 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| Hernández González, A. 2021. Producción de bionanorreactores mitodirigidos con actividad timidina fosforilasa para el potencial tratamiento del síndrome de encefalomiopatía neurogastrointestinal mitocondrial (MNGIE). Tesis de Maestría en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 55 pp. | |
| PRODUCTOS DE ARCILLA | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Nanociencias |
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| tesis_Angélica Hernández González_23 nov 2021.pdf | Versión completa de la tesis | 9.11 MB | Adobe PDF | Visualizar/Abrir |