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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/3700| Regulation of endocytosis in Neurospora crassa and its role in morphogenesis Regulación de la endocitosis en Neurospora crassa y su papel en la morfogénesis | |
| Marisela Garduño Rosales | |
| Rosa Reyna Mouriño Pérez | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Neurospora crassa, endocytosis, exocytosis, subapical collar, patches Neurospora crassa, endocitosis, exocitosis, collar subapical, parches | |
| El presente estudio examina aspectos fundamentales de la endocitosis como un proceso involucrado en la morfogénesis y crecimiento polarizado. Se desarrolló un procedimiento de fotoblanqueamiento basado en FRAP (por sus siglas en inglés, Recuperación de Fluorescencia Post-Fotoblanqueamiento) para medir la endocitosis en hifas de Neurospora crassa que expresan la proteína endocítica fimbrina, etiquetada con la proteína verde fluorescente (FIM-1-GFP). Se calculó que, bajo condiciones de crecimiento estándar, cerca del 12.5% de la membrana plasmática descargada en el ápice se endocita en el subápice, con una ocurrencia promedio de 21.4 eventos endocíticos/min/µm2 en un área del collar endocítico de 236.7 µm2. El procedimiento FRAP se realizó también en hifas crecidas en escasez de nutrientes y se encontró una ocurrencia promedio de 30.4 eventos endocíticos/min/µm2 en un área del collar endocítico de 79.1 µm2. Adicionalmente, se midió la internalización del reportero de endocitosis FM4-64 y se encontró los mismos valores de intensidad de fluorescencia en ambas condiciones de nutrientes. Se siguió la germinación de conidios para descifrar el establecimiento del collar endocítico utilizando las cepas FIM-1-GFP y FIM-1-mChFP/CHS-1-GFP (quitina sintasa 1). Se encontró que al principio los parches endocíticos forman una capucha en la punta del germínula y cuando el tubo germinal alcanza una longitud de ~150 µm, el arreglo de los parches comienza a cambiar a un collar subapical. Adicionalmente, se realizaron experimentos de daño mecánico en hifas maduras con el reportero de actina Lifeact etiquetado con GFP para seguir la dinámica de parches endocíticos y otras estructuras de actina de alto orden durante la regeneración de hifas y el re-establecimiento del crecimiento polarizado. Se estableció una línea de tiempo de la dinámica de las estructuras de actina de alto orden y se encontró que la remodelación de la pared celular y la membrana plasmática gracias a los parches endocíticos tiene un papel esencial en la regeneración de hifas. Adicionalmente, se visualizó a la proteína endocítica de cubierta temprana AP180 etiquetada con GFP y se observó que se localiza principalmente en el collar endocítico pero también en parches dispersos a lo largo de la hifa. Se observó el fenotipo de la cepa “knock out” Δap180 que resulta letal para las ascosporas, y otra mutante que carece del dominio N-terminal ANTH (AP180ΔANTH-GFP), la cual es incapaz de forman un collar. Y ... The present study examines fundamental aspects of endocytosis as a process involved in morphogenesis and polarized growth. We developed a photobleaching procedure based on FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) to measure endocytosis in hyphae of Neurospora crassa expressing the endocytic reporter fimbrin with a green fluorescent protein tag (FIM-1-GFP). We calculated that under standard growth conditions about 12.5% of the plasma membrane discharged in the apex becomes endocytosed in the subapex, with an average of occurrence of 21.4 endocytic events/min/µm2 in an endocytic collar area of 236.7 µm2. We conducted the FRAP procedure in hyphae grown in scarcity of nutrients and found an average occurrence of 30.4 endocytic events/min/µm2 in an endocytic collar area of 79.1 µm2. Additionally, we measured the internalization of the endocytic marker FM4-64 and found the same values of fluorescence intensity in both nutritional conditions. We followed conidial germination to assess the establishment of the endocytic collar using the strains FIM-1-GFP y FIM-1-mChFP/CHS-1-GFP (chitin synthase 1). We found that at the beginning endocytic patches form a cap at the very tip of the germling and once the germ tube reaches a length of ~150 µm, the arrangement of patches starts shifting to a subapical collar. Additionally, we performed mechanical injury experiments in mature hyphae with the actin reporter Lifeact tagged with GFP to follow the dynamics of endocytic patches and other high order actin structures during hyphal regeneration and re-establishment of polarized growth. We established a timeline of the dynamics of actin high order structures and found that remodeling of the cell wall and plasma membrane involving the endocytic patches plays an essential role in hyphal regeneration. Additionally, we visualized the early coat endocytic protein AP180 tagged with GFP and observed that it primarily localizes at the endocytic collar but also as scattered patches along the hypha. We observed the phenotype of the “knock out” mutant Δap180 which is ascospore lethal, and another mutant lacking the N-terminal ANTH domain (AP180ΔANTH-GFP) that is not able to form a collar. Finally, we immunoprecipitated AP180-GFP and found actin-binding proteins as possible interactors. Taken together our results reveal an interesting and novel insight to the endocytic collar, demonstrating that it is necessary for membrane recycling, a process that operates in tandem with ... | |
| CICESE | |
| 2022 | |
| Tesis de doctorado | |
| Inglés | |
| Garduño Rosales, M. 2022. Regulation of endocytosis in Neurospora crassa and its role in morphogene. Thesis Doctor of Science. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 59 pp. | |
| MICROBIOLOGÍA | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
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| tesis_Marisela Garduño Rosales_31 marzo 2022.pdf | Versión completa de la tesis | 3.52 MB | Adobe PDF | Visualizar/Abrir |