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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/3838| Neutralización del TGF-β con betaglicano soluble mediante exosomas en un modelo de nicho pre-metastásico hepático Neutralización del TGF-β con betaglicano soluble mediante exosomas en un modelo de nicho pre-metastásico hepático | |
| Erendira Guadalupe Olvera Felix | |
| PIERRICK GERARD JEAN FOURNIER | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| exosomas, nicho pre-metastásico, betaglicano soluble, TGF-β exosomes, pre-metastatic niche, soluble betaglycan, TGF-β | |
| Los pacientes con cáncer mueren principalmente por metástasis, siendo el hígado un sitio común. La colonización, etapa limitante de la metástasis, es favorecida por un nicho pre-metastásico (NPM) inducido por el tumor primario. En el hígado, el NPM se caracteriza por ser un ambiente fibrótico, promovido por el TGF-β o factor de crecimiento transformante-β, una citocina esencial para el desarrollo del cáncer. Para neutralizar al TGF-β, se planteó utilizar como vehículos exosomas cargados con ARNm de betaglicano soluble (sBG), un inhibidor del TGF-β. Usamos transducción lentiviral de células 293T para producir sBG con o sin secuencias de “códigos postales” en 3’UTR y aumentar la transferencia del ARNm a exosomas. Se comprobó la expresión de los ARNm por RT-qPCR y la producción/secreción de la proteína por Western blot. Aislamos exosomas y ectosomas y detectamos sBG, pero a niveles bajos comparado con las células. Los códigos postales no mejoraron la transferencia del ARNm a los exosomas, pero sí a los ectosomas. Como modelo de NPM-hepático utilizamos macrófagos RAW-264.7 que producen TGF-β. Confirmamos por Western blot que su medio condicionado induce la fosforilación de SMAD2/3 en células hepáticas HepG2. Cultivamos RAW-264.7 con vesículas extracelulares fluorescentes y se confirmó su internalización en >95% de las células. Las vesículas extracelulares entregaron el ARNm de sBG en las células RAW-264.7 y se detectó la proteína en su medio condicionado, pero en bajas cantidades. Este medio condicionado neutralizó la vía de señalización del TGF-β en células HepG2, sin embargo, el efecto neutralizante se detectó solo en una condición, la cual tuvo la mayor transferencia de ARNm de sBG de los exosomas a las células RAW-264.7. En conclusión, logramos modificar células 293T para obtener exosomas con el ARNm de sBG, que inducen la producción de sBG y neutralizan al TGF-β en un modelo de NPM. Sin embargo, se necesita aumentar la cantidad de ARNm en los exosomas para potenciar su efecto terapéutico. Metastases are responsible for most of the cancer-associated deaths and the liver is a common site of metastasis. During the development of metastasis, the colonization of the new organ is the limiting step and is favored by a pre-metastatic niche (PMN) induced by the primary tumor. The PMN in the liver is a fibrotic environment that is promoted by TGF-β or transforming growth factor-β that is essential to the development of cancer. To neutralize TGF-β, we proposed to used exosomes as vehicles loaded with soluble betaglycan (sBG), an inhibitor of TGF-β. We used lentiviral transduction of 293T cells to produce sBG with or without “Zip codes” sequences in 3’UTR that could increase the transfer of mRNA to exosomes. The expression of mRNA was confirmed by RT-qPCR and protein production/secretion by Western blot. We isolated exosomes and ectosomes and detected sBG, but at low levels compared to cells. Zip codes did not enhance mRNA transfer to exosomes, but did to ectosomes. To simulate the hepatic-PMN, we used RAW-264.7 macrophages that produce TGF-β. We confirmed by Western blot that their conditioned media induced SMAD2/3 phosphorylation in HepG2 liver cells. We cultured then RAW-264.7 with fluorescent extracellular vesicles and confirmed their internalization in >95% of the cells. Extracellular vesicles delivered sBG mRNA into RAW-264.7 cells and sBG was detected in their conditioned medium, but in low amounts. This conditioned medium neutralized the TGF-β signaling pathway in HepG2 cells, however, the neutralizing effect was detected only in one condition, which had the highest transfer of sBG mRNA from exosomes to RAW-264.7 cells. In conclusion, we were able to modify 293T cells to obtain exosomes with sBG mRNA, which induce sBG production and neutralized TGF-β in a PMN model. Nevertheless, it is necessary to increase the amount of mRNA in exosomes to enhance its therapeutic effect. | |
| CICESE | |
| 2023 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| Olvera Felix, E.G. 2023. Neutralization of TGF-β with soluble betaglycan through exosomes in a hepatic pre-metastatic niche model. Tesis de Maestría en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 61 pp. | |
| OTRAS | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
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