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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/3851| Desarrollo de un anticuerpo tipo vNAR fluorescente para uso en microscopía de fluorescencia Development of a fluorescent vNAR-type antibody for use in fluorescence microscopy | |
| Adolfo Romero Favela | |
| Alexei Fedorovish Licea Navarro | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| microscopía de fluorescencia, vNAR, IgG, tubulina Fluorescence microscopy, vNAR, IgG, tubulin | |
| En esta tesis se presenta un estudio para probar el uso de un vNAR de Heterodontus francisci, funcionalizado con un fluorocromo en aplicaciones de microscopía de fluorescencia para proteínas del microtúbulo. La microscopía de fluorescencia es una técnica esencial en la investigación biológica. Una de sus limitaciones es la poca variedad de moléculas disponibles para implementarla. Entre las estrategias exploradas se encuentra el uso de anticuerpos (IgG) fluorescentes, lo que permite tener una gran especificidad de detección de proteínas o moléculas. Con el fin de ampliar el repertorio de moléculas disponibles para hacer la técnica de microscopía de fluoresencia, se propuso utilizar un vNAR, que es un fragmento de un anticuerpo de tiburón (IgNAR), de tamaño 10 veces menor que el anticuerpo convencional, pero que conserva la especificidad por los antígenos. Con este planteamiento se espera que al utilizar un vNAR permita estudiar proteínas como las del microtúbulo o proteínas ≤50 kDa de igual manera que la IgG normal. Para lograrlo, se realizó el aislamiento de un vNAR (anti-α y β-tubulina) y se funcionalizó con un fluorocromo. La metodología comenzó con una bioselección mediante despliegue en fagos a partir de bibliotecas sintéticas. El protocolo optimizado para la obtención del vNAR comenzó con la inducción de las proteínas con IPTG en un cultivo de bacterias E. coli BL21, posteriormente un proceso de extracción de proteínas por choque osmótico o con ultrasonido, seguido de una ronda de purificación del lisado y repurificación de las fracciones por HisTrap FF. La detección del vNAR se realizó con electroforesis SDS-PAGE, Western Blot, ELISA y anticuerpos anti HA-HRP. Los vNARs obtenidos se conjugaron con el fluorocromo 660 C de la línea CF NHS. Posteriormente, se realizó microscopía de fluorescencia en fibroblastos humanos y se tomaron micrografías de las células con los microtúbulos marcados, además, se analizó la imagen con el programa FIJI. Finalmente, se logró aislar el vNAR ATH14, conjugarlo con el fluorocromo y hacer ensayos de microscopía de fluorescencia con un vNAR, sin embargo, no fue posible observar microtúbulos muy definidos. In this thesis, a study is presented to test the use of a vNAR from Heterodontus francisci, functionalized with a fluorochrome in fluorescence microscopy applications for microtubule proteins. Fluorescence microscopy is an essential technique in biological research. One of its limitations is the few varieties of molecules available to implement it. One of the strategies is the use of fluorescent antibodies (IgG), which allows a high specificity detection of proteins or molecules. In order to expand the repertoire of molecules available for the fluorescence microscopy technique, it was proposed to use a vNAR, which is a fragment of a shark antibody (IgNAR), 10 times smaller in size than the conventional antibody, but which retains specificity for antigens. With this approach, it is expected that when using a vNAR it will allow the study of proteins such as those of the microtubule or proteins ≤50 kDa in the same way as normal IgG. To achieve this, a vNAR (anti-α and β-tubulin) was isolated and functionalized with a fluorochrome. The methodology started with a phage display bioselection from synthetic libraries. The optimized protocol for obtaining the vNAR began with the addition of the inducer IPTG to a culture of E. coli BL21 bacteria, then the protein extraction process was made by osmotic shock or ultrasound, followed by a round of purification of the lysate and repurification of the vNAR’s fractions by HisTrap FF chromatography. The vNAR detection was performed with SDS-PAGE electrophoresis, Western Blot, ELISA and anti-HA-HRP antibodies. The vNARs obtained were conjugated with the fluorochrome 660 C of the CF™ NHS line. Then, fluorescence microscopy was performed on human fibroblasts and micrographs of the cells with the labeled microtubules were taken, in addition, the image was analyzed with the FIJI program. In conclusion, it was possible to isolate the vNAR ATH14, conjugate it with the fluorochrome and perform fluorescence microscopy assays with a vNAR. However, it was not possible to observe well defined microtubules. | |
| CICESE | |
| 2023 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| Romero Favela, A. 2023. Desarrollo de un anticuerpo tipo vNAR fluorescente para uso en microscopía de fluorescencia. Tesis de Maestría en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 47 pp. | |
| MICROSCOPIA | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
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| tesis_Adolfo Romero Favela_24 feb 2023.pdf | Versión completa de la tesis | 2.04 MB | Adobe PDF | Visualizar/Abrir |