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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/4293| Desarrollo de exosomas αVβ₅+ como una terapia anti-TGF-β dirigida al nicho pre-metastásico hepático Development of αVβ5+ exosomes as an anti-TGF-β therapy targeting the hepatic pre-metastatic niche | |
| BLANCA PALOMA ACOSTA MONTAÑO | |
| PIERRICK GERARD JEAN FOURNIER | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| cáncer, metástasis hepática, terapia dirigida, exosomas, integrinas cancer, liver metastasis, targeted therapy; exosomes; integrins | |
| La metástasis al hígado es común en cáncer pancreático y colorrectal. Su desarrollo es promovido por exosomas secretados por el tumor primario, que, por la presencia de la integrina αVβ₅ en su membrana, se dirigen al hígado. Internalizados en células de Kuppfer, que son macrófagos residentes en el hígado, estos exosomas incrementan la producción de TGF-β iniciando la formación del nicho pre-metastásico que aumenta la probabilidad de formación de metástasis. Considerando que las terapias anti-TGF-β no han sido eficientes en ensayos clínicos y causan efectos secundarios, nuestro objetivo fue desarrollar una terapia anti-TGF-β dirigida al hígado utilizando exosomas funcionalizados con la integrina αVβ₅. Para esto seleccionamos las células 293T, una línea celular humana, no cancerosa en las cuales detectamos la expresión endogénica de la integrina αVβ₅. Los exosomas se purificaron mediante centrifugación diferencial. Las vesículas obtenidas tuvieron un diámetro de 111 ± 44.0 nm, de acuerdo con los análisis de dispersión de luz dinámica y microscopía electrónica de transmisión, y contienen la proteína CD81, un marcador de exosomas, lo que cumple con los criterios para exosomas. Cuando los exosomas marcados fluorescentemente se inocularon por vía intravenosa en ratones, fueron detectados en el hígado 24 horas después. Para incrementar la localización de estos exosomas en el hígado, se sobreexpresó la integrina αVβ₅. Las células 293T fueron transfectadas con plásmidos que codifican para las subunidades αV y β₅, y seleccionadas para obtener un subclon con niveles de expresión 9 veces mayor en comparación con las células parentales. Por medio de western blot, confirmamos que los exosomas derivados de este subclon contienen la integrina exógena. In vitro, la internalización de exosomas αVβ₅+ fue mayor en macrófagos (RAW 264.7). En ratones, la sobreexpresión de αVβ₅ incrementó las cantidades de estos exosomas en el hígado (4.9x vs parental) y estos exosomas αVβ₅+ se localizaron preferentemente en el hígado comparado con pulmones, riñones y cerebro. Para cargar los exosomas con una agente anti-TGF-β, decidimos usar un estrategia de ARN de interferencia con shRNA. Células 293T-αVβ₅+, fueron transducidas para producir shRNA con Tgfb1 (shTgfb1) para que sean cargados directamente en los exosomas. Aunque ambos shTgfb1 silenciaron eficientemente Tgfb1 en células de ratones transducidas, los exosomas derivados de las células 293T no disminuyeron los Liver metastasis is a common complication in pancreatic and colorectal cancer. Its development is promoted by exosomes, extracellular vesicles, secreted by the primary tumor that accumulate in the liver due to the presence of the αVβ₅ integrin on their membrane. Once in the liver, exosomes are internalized by Kupffer cells, the resident macrophages in the liver, increasing their production of TGFβ, the first step in establishing the pre-metastatic niche that supports metastasis formation. Since antiTGF-β therapies have not been effective in clinical trials and cause side effects, our aim was to develop a liver-targeted anti-TGF-β treatment using exosomes functionalized with the αVβ₅ integrin. We selected 293T cells as a human, non-cancerous cell line, in which we detected the expression of endogenic integrin αVβ₅ to obtain exosomes using differential centrifugation. From the conditioned medium of 293T cells, we isolated vesicles that had a diameter of 111 ± 44.0 nm, as determined by dynamic light scattering analysis and transmission electron microscopy, and contained CD81, an exosome marker, which corresponds to exosome characteristics. We used fluorescently labeled exosomes to follow exosomes in vivo. After intravenous inoculation into mice, exosomes were detected in the liver 24 hours later. To enhance the accumulation of 293T exosomes in the liver, we decided to overexpress the integrin αVβ₅. 293T cells were transfected with plasmids encoding the αV and β₅ subunits. After antibiotic selection and clonal expansion, we obtained a subclone of 293T cells that had 9-times more αVβ₅ integrin on their surface, and we confirmed these exosomes contained the exogenous integrin. In vitro, αVβ₅+ exosomes showed higher uptake in RAW 264.7 macrophage cells, compared to parental exosomes. In mice, we confirmed that αVβ₅ overexpression significantly increased exosome localization in the liver (4.9x vs parental) and that αVβ₅+ exosomes preferentially accumulated in the liver compared to the lungs, kidneys, and brain. To load the exosomes with an antiTGF-β agent, we chose to use RNA interference with shRNA. 293T-αVβ₅+ cells were transduced to produce different shRNA against Tgfb1 (shTgfb1) to be directly loaded into their exosomes. Although both shTgfb1 efficiently silenced Tgfb1 in transduced mouse cells, exosomes derived from 293T cells did not reduce Tgfb1 levels in RAW 264.7 cells. Despite not achieving the loading of exosomes with a TGF-β in | |
| CICESE | |
| 2025 | |
| Tesis de doctorado | |
| Español | |
| Acosta Montaño, B.P. 2025. Desarrollo de exosomas αVβ₅+ como una terapia anti TGF-β dirigida al nicho pre-metastásico hepático. Tesis de Doctorado en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 96 pp. | |
| OTRAS | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
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