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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/546| Análisis comparativo de los niveles de expresión de fragmentos de anticuerpos recombinantes vNAR en Pichia pastoris y Escherichia coli Comparative analysis of expression levels of recombinant antibody fragments vNAR in Pichia pastoris and Escherchia coli | |
| Olivia Cabanillas Bernal | |
| ALEXEI FEDOROVISH LICEA NAVARRO | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Tumor Necrosis Factor Alpha,Antibody vNAR,Endotoxic shock,Anticuerpos vNAR,Factor de Necrosis Tumoral Alfa,Choque endotóxico,Escherichia coli,Pichia pastoris | |
| Los fragmentos de anticuerpo de dominio sencillo (~12 kDa), han mostrado ventajas sobre las moléculas de anticuerpo convencionales (~150 kDa) respecto a su aplicación clínica. La tecnología de ADN recombinante ha permitido la reducción al mínimo de los fragmento de anticuerpo que mantiene la afinidad parental de unión al antígeno. Un tipo distintivo de inmunoglobulina llamado IgNAR (nuevo receptor de antígeno) ha sido identificado en los peces cartilaginosos como los tiburones. Las IgNAR's carecen de cadenas ligeras y tienen la región de unión al antígeno comprendida en un solo dominio de cadena pesada denominado vNAR. Los dominios vNAR tienen características particulares como un tamaño pequeño (12-15 kDa), su CDR3 largo (13-23 residuos de aminoácidos), estabilidad térmica, estabilidad química y resistencia a pH gástrico. En el presente trabajo se compararon dos modelos de expresión (Escherichia coli y Pichia pastoris) con la finalidad de determinar cual sistema produce el mayor rendimiento del anticuerpo vNAR denominado T43. Este vNAR tiene la capacidad de neutralizar al Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFα), una citocina que al expresarse en altas concentraciones está implicada de manera negativa en algunas enfermedades inflamatorias agudas. Se utilizó la cepa Origami 2 (DE3) de E. coli, la cual posee mutaciones en los genes tiorredoxina reductasa (trxB) y glutatión reductasa (gor), lo que mejora considerablemente la formación de enlaces disulfuro en el citoplasma y favorece el plegamiento de proteínas. A demás se empleó la cepa SMD1168 de P. pastoris, que es deficiente de proteasas A. Previo a la expresión, se optimizaron las condiciones de inducción de la expresión del vNAR T43 en los dos microorganismos. Los rendimientos obtenidos fueron de 4.66 mg/L para P. pastoris, mientras que para E. coli se evaluaron dos vectores, el pET101/D y pComb3x que presentaron rendimientos de 0.90 mg/L y 0.27 mg/L respectivamente. Para verificar la capacidad de neutralización in vivo del efecto de TNFa por el vNAR T43 producido en ambos modelos de expresión, se empleó un modelo de choque endotóxico en ratones Balb/c. Existe un aumento en la supervivencia de al menos 12 horas en los ratones tratados con los anticuerpos vNAR respecto al control sin tratamiento. No se encontró diferencia entre la actividad del vNAR T43 expresado en la cepa SMD1168 de P. pastoris y la cepa Origami 2 (DE3) de E. coli. Estos resultados sugieren que los dos modelos de expresión empleados son capaces de producir el vNAR T43 de forma activa y funcional, siendo P. pastoris el modelo que proporciona el mayor rendimiento de expresión (hasta cinco veces mayor que el de E. coli). Single-domain antibody fragments (~12 kD), have shown advantages over conventional antibody molecules (~150 kD) in regards to their clinical application. Recombinant DNA technology has allowed the reduction to the minimal antibody fragment that maintains the parental union affinity to the antigen. A distinct type of immunoglobulin called IgNAR (new antigen receptor) has been identified in cartilaginous fish such as sharks. The IgNAR's lack light chains and have the antigen-binding fragments comprised in a single heavy chain domain termed vNAR. These vNAR domains have particular characteristics such as small size (12-15 kD), long CDR3 loop (13-23 aminoacids residues), thermal stability, chemical stability and resistance to gastric pH. In this study two expression models were compared (Escherichia coli and Pichia pastoris) with the objective of determining which system will provide the higher yield of a vNAR antibody called T43. This vNAR has the capacity to neutralize the Tumor Necrosis Factor Alpha (TNFα), a cytokine implicated in a negative way in some acute inflammatory diseases. An E. coli Origami 2 (DE3) strain was used, that has mutations in the thioredoxin reductase (trxB) and glutathione reductase (gor) genes, which considerably improve the formation of disulfide bonds in the cytoplasm and favor protein folding. The P. pastoris SMD1168 strain deficient in aspartyl proteases was also used. Previous to expression, induction conditions were optimized for expression of the vNAR in both microorganisms. The yields obtained were 4.66 mg/L for P. pastoris, while for E. coli two vectors were evaluated, pET101/D and pComb3x which presented yields of 0.90 mg/L and 0.27 mg/L respectively. To verify the in vivo neutralizing capacity of the TNFα by the T43 vNAR produced in both expression models, an endotoxic shock model was employed in Balb/c mice. There is an increase in survival of least 12 hours in mice treated with the vNAR antibody compared to the untreated control. No difference was found in T43 protein activity expressed in P. pastoris SMD1168 strain and E. coli Origami 2 (DE3) strain. These results suggest that both expression models are capable of producing active and functional T43 vNAR, being P. pastoris the expression model that provided a higher expression yield (up to five times that of E. coli). | |
| CICESE | |
| 2014 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| Cabanillas Bernal, O.2014.Análisis comparativo de los niveles de expresión de fragmentos de anticuerpos recombinantes vNAR en Pichia pastoris y Escherichia coli.Tesis de Maestría en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. | |
| MICROBIOLOGÍA | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
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