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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/594| Isolation and characterization of heavy chain single-domain antibodies from the horn shark Heterodontus francisci against murine CD38 Aislamiento y caracterización de anticuerpos de cadena pesada de dominio sencillo del tiburón Heterodontus francisci dirigidos contra CD38 murino | |
| Karla Oyuky Juárez Moreno | |
| ALEXEI FEDOROVISH LICEA NAVARRO Friedrich Haag | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| IgNAR,Heterodontus francisci,Tiburón toro,CD38,Ciencias del mar | |
| Además de los anticuerpos convencionales, los tiburones desarrollaron anticuerpos compuestos por la cadena polipeptídica pesada denominados IgNAR, el fragmento variable de éstos se designa como vNAR y constituye los dominios de anticuerpo más pequeños capaces de reconocer a un antígeno. El largo inusual de su CDR3, les permite penetrar en las cavidades de los sitios activos de las enzimas e inhibirlas. Considerando esta característica, uno de los objetivos de este proyecto consistió en aislar anticuerpos de dominio sencillo del tiburón Heterodontus francisci, a partir de una biblioteca inmune específica, capaces de unirse a la enzima CD38 murina. La proteína CD38 actúa como receptor en la sinapsis inmunológica, y como enzima está involucrada en la degradación extracelular del NAD+ . Clínicamente esta proteína se utiliza como marcador de prognosis en la Leucemia Linfocítica Crónica. En este proyecto se generaron y aislaron vNARs que específicamente se unen a CD38 murino. A partir de un tiburón inmunizado se obtuvo una biblioteca de vNARs altamente diversa, después de varias rondas de selección se aislaron 16 familias. Las proteínas recombinantes así como los fago-anticuerpos fueron utilizados para probar su actividad de reaccionar específicamente contra CD38 en un ensayo de ELISA, los resultados revelaron que todas las familias con excepción de una eran capaces de unirse a CD38. A pesar de esto, ninguno de los vNARs aislados fue capaz de inhibir la actividad hidrolítica de la enzima. Se realizaron ensayos de FACS sobre células que expresaban CD38 en su membrana, como células de bazo de ratón y células de linfoma. De esta forma se identificó que los vNAR tenían una capacidad baja de unirse a células de bazo de ratón, pero se unían de manera favorable a las células de linfoma EL4-R (CD38pos). Hasta el momento se sabe que la familia SAGTK es la que mejor reacciona contra la enzima CD38 de ratón. El segundo objetivo del proyecto, fue generar anticuerpos capaces de reconocer moléculas de tipo vNAR, para ello se inmunizaron tres ratones con un vNAR purificado. Los ratones inmunizados desarrollaron una respuesta inmune específica, por lo que se utilizó el bazo y los nodos linfñaticos de uno de ellos para generar anticuerpos monoclonales. De la fusión celular se aislaron clonas capaces de reconocer una variedad de vNARs, después de subclonar las células fusionadas, se aislaron los anticuerpos monoclonales 370 y 533 ambos con un isotipo IgG1k. Usando los anticuerpos monoclonales (MAb) #379 y #533 en ensayos de ELISA y dot blot, se detectó específicamente diferentes vNARs y suero de tiburón. Además se evaluó si ambos MAb eran capaces de detectar alguna molécula presente en el suero del tiburón H. francisci, demostrándose que una molécula de aproximadamente 80 kDa fue inmuno-precipitada y detectada por Western blot utilizando el MAb 370. Otras dos proteínas del suero de tiburón fueron precipitadas, pero no detectadas por western blot, la primera con un peso molecular de 160 kDa y la segunda con un peso entre los 160 y 260 kDa. Todas estas moléculas están actualmente siendo analizadas por espectometría de masas para identificar la naturaleza de cada una de ellas, hasta la fecha se tiene la secuencia parcial de la proteína de 80 kDa que se confirmó como un IgNAR de H. francisci. Por otro lado, los MAbs 370 y 533 se utilizaron para determinar si en el curso de una inmunización de un tiburón H. francisci existían cambios en la especificidad del suero con el antígeno utilizado. Los resultados obtenidos utilizando el MAb 370 como método de detección en un ensayo de ELISA, muestran que después de 10 días posteriores a la inmunización, existe un reconocimiento específico al antígeno, dicha señal alcanza su punto más alto entre los días 26 y 40. Se demostró también que ante la falta de la administración de antígeno, la respuesta específica disminuye e incrementa de forma rápida ante una nueva administración. Los resultados obtenidos hasta ahora representan el primer acercamiento para investigar si existe una respuesta antígeno específica durante los procesos de inmunización del tiburón H. francisci y para determinar si existe maduración de la afinidad de los anticuerpos mediante un proceso dirigido por el antígeno. Besides conventional antibodies, sharks have evolved unusual antibodies compose only of the heavy chain, its variable domains are designated as vNAR, and are the smallest known antigen-binding antibody fragments exhibiting a high degree of chemical and thermal stability. Its unusual long CDR3 allows them to penetrate into the active site of enzymes and inhibit its activity, which makes them excellent enzymatic inhibitors. Therefore, one of the goals of this project was to isolate single domain antibodies from shark immune library specific for murine CD38 with binding and inhibitory activity. The CD38 protein has a dual function, as an adhesion molecule plays important roles in the immunological synapse and as enzyme, acts as an ecto-NADase, involved in extracellular NAD+ degradation. Clinically CD38 is a prognostic marker in Chronic Lymphocytic Leukemia. In this work we present the generation and isolation of vNARs that specifically bind to murine CD38. High diversity phage display library was obtained from immunized shark, with it several rounds of selection were performed and 16 vNAR families were isolated. Purified vNAR proteins and vNAR-phages were used to test their reactivity to CD38; revealing that all the families but one, specifically reacts with the enzyme. Although vNAR families bound to soluble CD38 protein, they were unable to inhibit its NADase enzymatic activity. However, to corroborate the binding capacity of isolated vNARs, FACS analysis were further accomplished on cells that express CD38 as cell-surface protein, a low reactivity was shown by vNAR-phages on mouse spleenocytes, whereas on CD38pos mouse lymphoma cell line EL4-R the reactivity was higher and specific. At the very end, the family SAGTK had a better binding reactivity to CD38. The second major goal of this project was to generate second reagents able to recognize vNAR molecules. Thee mice were immunized with a purified vNAR protein (SAALAK), a specific immune response against it was developed by the mice. To make monoclonal antibodies, the lymph nodes and spleen from one of the mice were taken and fused together with a myeloma cell line. From fused cells, positive clones reacting against a wide variety of VNAR molecules were isolated, after subcloning; two hybridoma cells #370 and #533 retained the ability to specifically react with vNARs. The isotype of both clones were determined as IgG1k. Monoclonal antibodies #370 and #533 specifically detect vNARs and shark serum by ELISA and dot blot. Furthermore, it was tested whereas MAbs 370 and 533 were able to detect any molecule present in the serum from horn shark Heterodontus francisci, and it was shown by an immunoprecipitation assay that a iv molecule of ~80kDa was specifically precipitated and detected by Western blot using the hybridoma #370. Two other shark serum´s proteins were precipitated but not detected by western blot (one of 160 kDa and other in between 160 and 260 kDa). Mass spectrometry analysis of all the identified molecules is currently underway, to determine the identity of them and confirm whereas the 80kDa molecule is indeed a IgNAR molecule. In addition, MAbs 370 and 533 were used to determine if during the course of an immunization protocol of one H. francisci shark, there are any changes in the specific reactivity of serum molecules with an specific antigen. The obtained results using MAb 370 to detect the reactivity indicated that there is an specific-antigen response developed by the immunized sharks then after 10 days post immunization and raising the higher point in between days 26 and 40 post immunization, it was also shown that in the absence of antigen, the levels of reactivity decrease, but soon after boost administration, the specific response increase. This represents the first attempts to investigate if there is a specificantigen response during the immunization of horn sharks and determine whereas an affinity maturation process is taking place by means of an antigen-driven process. | |
| CICESE | |
| 2011 | |
| Tesis de doctorado | |
| Español | |
| Juárez Moreno, K.O.2011.Isolation and characterization of heavy chain single-domain antibodies from the horn shark Heterodontus francisci against murine CD38.Tesis de Doctorado en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. | |
| MICROBIOLOGÍA | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
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