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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/602| Caracterización, localización y función del módulo CDC-42-RAC-CDC-24 y de las proteínas BUD-2 y BUD-5 en el hongo filamentoso Neurospora crassa Characterization, localization and function of the module CDC-42 – RAC – CDC-24 and the proteins BUD-2 and BUD-5 in the filamentous fungus Neurospora crassa | |
| Cynthia Lizzeth Araujo Palomares | |
| Riquelme Pérez Meritxell Ernestina Castro Longoria | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Hongo filamentoso,Neurospora crassa,CDC-42,RAC,CDC-24,BUD-2,BUD-5,Ciencias del mar | |
| Neurospora crassa es un hongo filamentoso que se caracteriza por la formación de hifasaltamente polarizadas. La morfogénesis de las hifas requiere del establecimiento y delmantenimiento de la polaridad celular, ambos procesos son regulados por múltiplescomplejos proteicos. Las proteínas Rho GTPasas son consideradas importantes en laregulación de la polaridad celular en eucariotas, por lo que en este trabajo se analizó elmódulo constituido por las Rho GTPasas CDC-42, RAC y su activador, el factor deintercambio de guanina (GEF) CDC-24 en el hongo N. crassa. Cdc-42p se ha denominadocomo el regulador maestro de la polaridad en levaduras, sin embargo en este trabajo secomprobó que para N. crassa este gen no es esencial. Se determinó que las mutantes Δcdc-42 y Δrac son viables, aunque con fenotipos que presentan colonias muy compactas e hifascon morfología irregular, mientras que las dobles mutantes con pérdida de alelos de cdc-42y rac son letales, sugiriendo que ambas proteínas comparten al menos una función esencial.Por otro lado, se observó que la mutante de Δcdc-24 es letal, lo cual sugiere que el GEFCDC-24 es fundamental para la activación de CDC-42 y RAC. Mediante el análisis in vivopor microscopía confocal se determinó que el módulo CDC-42 – RAC – CDC-24 estáasociado a la membrana celular y organizado en forma de capucha apical cuando esetiquetado con proteínas fluorescentes en el extremo N-terminal. Las tres proteínas selocalizaron en el domo apical de las hifas con una distribución distinta y aparentementecomplementaria. CDC-42 está confinada en forma de media luna a la membrana del ápicecelular, RAC también está asociada a membrana pero en forma de anillo, excluyendo laregión ocupada por CDC-42. CDC-24 ocupó una posición estratégica asociándose amembrana plasmática en forma creciente en el ápice celular, así como en el citosol apicalexcluyendo la zona del Spitzenkörper (Spk). Por otra parte, CDC-42 y RAC presentaronuna localización temporal distinta durante el proceso de formación de ramificaciones ydurante la germinación de esporas. Ambas proteínas se acumularon en la membrana iiplasmática antes de la formación de una rama. Sin embargo CDC-42 apareció primero queRAC, aproximadamente un minuto antes de la emergencia de la rama, mientras que RACapareció después, alrededor de 20 segundos antes de la emergencia de la rama. Durante lagerminación, GFP-CDC-42 se acumula en una región específica en la membrana celular deesporas durante la fase de hidratación y en los ápices de los tubos germinativos, mientrasque RAC aparece una vez que se ha formado el tubo germinativo. Esto sugiere que ambasGTPasas juegan un papel importante en la regulación de la polaridad celular. CDC-42aparentemente participa en la iniciación de la polarización celular mientras que la funciónprincipal de RAC pudiera ser el mantenimiento de un crecimiento polarizado. Lageranilgeranilación de CDC-42 es importante para su anclaje a membrana, ya que aletiquetar CDC-42 con la proteína fluorescente mCherry en el C-terminal, lageranilgeranilación se ve interrumpida y el patrón de localización difiere con respecto aletiquetamiento en el extremo N-terminal. Tanto en hifas maduras como en germínulas lalocalización de CDC-42-mCherryFP se observó en el ápice celular ocupando la partecentral del Spk, sugiriendo que la localización en membrana plasmática depende de lageranilgeranilación. Sin embargo al parecer ésta no es importante para llevar a cabo sufunción ya que la polaridad celular es restablecida en la cepa homocarión obtenidamediante la cruza genética de la mutante Δcdc-42 con la cepa cdc-42::mchfp. Además lalocalización de CDC-42-mCherryFP durante la formación de septos y ramificacioneslaterales no se ve afectada.Otros componentes involucrados en el establecimiento de la polaridad celular y enmantener un crecimiento polarizado en levaduras son las proteínas BUD-2 y BUD-5 que enN. crassa muestran distintos patrones de localización tanto en hifas maduras como engermínulas. En hifas maduras BUD-2 es confinada al ápice celular ocupando la partecentral del Spk, mientras que BUD-5 se observó tanto de forma citosólica, con un puntobrillante en la parte central dando la apariencia de abanico, como asociada a la membranaapical, por lo que ambas proteínas colocalizan parcialmente. Durante la germinación deesporas y en la elongación de las germínulas, BUD-2 se observó en la membranaplasmática apical, mientras que BUD-5 se encontró tanto de forma citosólica en el ápicecomo asociada a la membrana apical. Así mismo ambas proteínas mostraron unalocalización distinta durante diversos eventos morfogenéticos donde BUD-2 participó en laformación de septos y BUD-5 en marcar los sitios de ramificaciones laterales. Esto sugiereque aparte del papel que ambas proteínas aparentemente juegan en el establecimiento de lapolaridad, también participan en diferentes procesos asociados a la morfogénesis celular deN. crassa. Neurospora crassa is a filamentous fungus that is characterized by the formation of highlypolarized hyphae, which is a morphogenetic event that requires the coordinated assemblingof multiple protein complexes to ensure the establishment and maintenance of cell polarity.Rho GTPases are key regulators that control eukaryotic cell polarity, therefore in this study,we analyzed the Rho GTPases CDC-42, RAC and their activator the guanine exchangefactor (GEF) CDC-24 in N. crassa. In yeast, Cdc-42p has been considered as a masterpolarity regulator; however in this study we demonstrate that for N.crassa this gene is notessential. We determined that Δcdc-42 and Δrac mutants are viable, although thephenotypes present very compact colonies and irregular hyphal morphology, while doublemutants carrying the loss of function alleles of cdc-42 and rac are lethal, suggesting thatboth cdc-42 and rac share at least one common essential function. On the other hand, it wasobserved that Δcdc-24 mutant is lethal, this suggest that the GEF CDC-24 is fundamentalfor CDC-42 and RAC activation. In vivo confocal microscopy shows that the CDC-42 –RAC – CDC-24 module is organized as a membrane-associated cap that covers the hyphalapex when are tagged with fluorescent proteins at the N-terminal The three proteins werepresent at the apical dome with a distinct but apparently complementary localization. CDC-42 occurs as an apical membrane-associated crescent, RAC is also membrane-associatedbut distributed as a ring excluding the region labeled by CDC-42, and CDC-24 occupied astrategic position, localizing as a broad apical membrane-associated crescent and in theapical cytosol excluding the Spitzenkörper (Spk). On the other hand, CDC-42 and RACalso display distinct temporal localization patterns during branching and spore germination.Both proteins were observed as an accumulation of fluorescence at the plasma membranebefore branch formation. However CDC-42 was observed before RAC, approximately oneminute before branch emergence, while RAC appeared after CDC-42, about 20 secondsbefore branch emergence. During germination, GFP-CDC-42 accumulates in a specificregion of the cell membrane of spores during the hydration phase and continues at theapices of germ tubes, while RAC appears only once the germ tube has been formed. Theselocalizations suggest that both GTPases play an important role for cell polarity regulation,apparently CDC-42 participate during polarity establishment, while the primary function ofRAC could be to maintain polar growth. CDC-42 geranylgeranylation is important formembrane attachment, because when CDC-42 was labeled by the mCherry fluorescentprotein at the C-terminal, the geranylgeranylation is disrupted and the localization patternof CDC-42 is different with respect at the tagged at the N-terminal. In both germlings andmature hyphae, CDC-42 was localized at the cell apex occupying the core of the Spk. This ivsuggests that membrane-association depends on the geranylgaranilation. However,apparently this is not necessary to carry out its function, because cell polarity was restoredin a homokaryon strain obtained by sexual crosses between Δcdc-42 and cdc-42::mchfpstrains. Additionally, CDC-42-mCherryFP localization during septa and branchingformation was not affected.Other components that are involved in the establishment and maintenance of cell polarityare the BUD-2 and BUD-5 proteins. In N. crassa both BUD-2 and BUD-5 display distinctlocalization patterns in both germlings and madure hyphae. In mature hyphae, BUD-2 isconfined to the apical cytosol occupying the core of the Spk, while BUD-5 was observed inthe apical region of the cell as a bright spot with higher intensity at the base adopting ahand fan shape and associated to the apical plasma membrane. Both proteins partiallycolocalized in the apical region. However, during spore germination and elongation ofgermlings, BUD-2 was associated to the plasma membrane, while BUD-5 was found bothin the cytosolic form and membrane-associated. BUD-2 and BUD-5 also display distinctlocalization patterns during some morphogenetics processes. BUD-2 is localized duringseptum formation, and BUD-5 was involved during initiation of lateral branches. Thissuggests that in addition to the role that both proteins apparently play in the establishmentof cell polarity, they also participate in different processes associated to cell morphogenesisof N. crassa. | |
| CICESE | |
| 2012 | |
| Tesis de doctorado | |
| Español | |
| Araujo Palomares, C.L.2012.Caracterización, localización y función del módulo CDC-42-RAC-CDC-24 y de las proteínas BUD-2 y BUD-5 en el hongo filamentoso Neurospora crassa.Tesis de Doctorado en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. | |
| MICROBIOLOGÍA | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
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