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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/633| Tráfico vesicular de las proteínas quitina sintasas y la ATPasa de H+ de membrana plasmática durante el crecimiento de Neurospora crassa Vesicular traffic of chitin synthases and the plasma membrane H+ ATPase during growth in Neurospora crassa. | |
| Rosa Aurelia Fajardo Somera | |
| Meritxell Riquelme Pérez | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Chitin synthases,Secretory pathway,Vesicular traffic,Membrana plasmática,Morfogénesis fúngica,Spitzenkörper,PMA-1,Quitina sintasas,Rutas de secreción,Tráfico vesicular,Fungal morphogenesis,Plasmatic membrane | |
| Las hifas de los hongos filamentosos son células tubulares a través de las cuales viajan vesículas secretoras, que se acumulan temporalmente en el Spitzenkörper (SPK) antes de fusionarse con la membrana plasmática (MP), dónde aportan enzimas y material necesario para sintetizar la pared celular. A su vez, bombas de H+ membranales contribuyen a generar un potencial de membrana que es utilizado para el cotransporte de nutrientes hacia el interior de la célula. Las rutas secretoras encargadas de dirigir estas proteínas clave en la morfogénesis fúngica son prácticamente desconocidas. El objetivo de este trabajo fue elucidar el tráfico de las quitina sintasas (CHS) clases II, IV, V y VII, y de la ATPasa de H+, PMA-1 en el hongo filamentoso Neurospora crassa. Para ello las proteínas fueron etiquetadas con la proteína verde fluorescente (GFP) usando la técnica de Split-marker. Se observaron todas las CHS en el centro del SPK y en septos en formación. Mediante microscopía de TIRF, se observaron quitosomas conteniendo CHS-5-GFP (con un dominio motor tipo miosina amino terminal) en movimiento a lo largo de cables de actina. La Latrunculina A impidió la acumulación de CHS-4, CHS-5 y CHS-7 en el SPK, lo cual respalda la participación de los cables de actina en el transporte de CHS. Asimismo, para investigar el papel de la proteína motora miosina de clase V en el tráfico de CHS, se co-expresó CHS-1-mChFP y MYO-2Δdil-GFP. La llegada de ambas proteínas al SPK sugirió que la CHS-1 se transporta independientemente de MYO-2. La coimmunoprecipitación de CHS-1, CHS-4 y CHS-5 etiquetadas con GFP utilizando GFP-TRAP® y espectrometría de masas permitió identificar varias proteínas putativas asociadas, posiblemente con un papel en la regulación de la secreción y actividad de las CHS; éstas incluyen CSR-4, una serina proteasa, una cinasa de homoserina, y también proteínas implicadas en el tráfico vesicular, tales como SEC-10 y SEC-14. Para estudiar el papel de cada CHS durante las diferentes etapas del desarrollo se analizaron cepas mutantes con los genes chs delecionados. Las chs-6 y chs-7 tienen un papel importante en el crecimiento vegetativo; chs-5 y chs-7 en la reproducción asexual; y chs-7 y chs-3 en la formación de estructuras sexuales. Todo ello sugiere que hay diferentes poblaciones de quitosomas, cada una conteniendo una clase de CHS, con funciones específicas durante las diferentes etapas de desarrollo. Por otro lado se caracterizó el tráfico y reparto de PMA-1. En conidios la PMA-1-GFP se distribuyó de manera uniforme en la MP. En tubos germinativos, la fluorescencia se observó a lo largo del tubo germinativo y fue menos intensa o ausente en la punta. En hifas, la PMA-1-GFP se localizó en la MP en las regiones distales y en septos ya formados, pero no en la punta, indicativo de una ruta secretora distinta a la seguida por las CHS e independiente del SPK. Análisis de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) sugirieron que la PMA-1-GFP que se incorpora a la MP, proviene de una fuente principalmente del citoplasma, y en mucho menor grado de la difusión lateral de las regiones adyacentes de la MP. Al añadir Brefeldina A (BFA), un inhibidor que bloquea la ruta de secreción RE-Golgi, desapareció la fluorescencia de las endomembranas tubulares localizadas en regiones apicales, sugiriendo un papel de éstas en el reciclaje de la proteína. Después de una exposición prolongada a BFA, la PMA-1-GFP se empezó a acumular en cuerpos de Brefeldina. El análisis de FRAP en vacuolas globulares en hifas tratadas con BFA reveló que el reciclaje endosomal fue bloqueado por el inhibidor BFA. Se sugiere que las CHS y la PMA-1 siguen diferentes rutas de secreción. Las vesículas que contienen PMA-1 son incorporadas directamente a la MP lejos de la ruta de secreción principal de proteínas de MP que viajan con el torrente de vesículas que se acumulan en la SPK antes de ser fusionadas en la MP de la región apical diferencia de las CHS, las cuales se concentran en el núcleo del SPK previa incorporación a la MP. Hyphae of filamentous fungi are tubular cells along inside which secretory vesicles travel to temporarily accumulate at the Spitzenkörper (SPK) before moving to and fusing with the plasma membrane (PM) to provide material and enzymes needed to synthesize the cell wall. Membrane H+ pumps generate a membrane potential used for the co-transport of nutrients into the cell. The secretory pathways responsible for sorting these key fungal morphogenesis related proteins are virtually unknown. The main goal of this study was to elucidate the vesicular traffic of CHS classes II, IV, V and VII and PMA-1, a PM H+-ATPase, in the filamentous fungus Neurospora crassa. All CHS were found at the core of the SPK and in forming septa. By total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) analysis putative particles presumably chitosomes containing CHS-5-GFP were revealed moving along wavy tracks, presumably actin cables. Latrunculin A prevented the accumulation of CHS-4, CHS-5 and CHS-7 in the SPK, supporting the participation of actin cables in the transport of CHSs. In addition, to investigate whether myosin motors are involved in the traffic of CHS, CHS-1-mChFP and MYO-2Δdil-GFP (Class V) were co-expressed. Arrival of both proteins to the SPK suggested that CHS-1 is transported independently of MYO-2. Coinmunoprecitation experiments using GFP-TRAP® and mass spectrometry for strains expressing GFP-tagged CHS-1, CHS-4 and CHS-5 were carried out; several putative CHS interacting proteins were identified, including CSR-4, a serine protease, a homoserine kinase, α-tubulin and also proteins involved in traffic such as SEC-10 and SEC-14. Knock out mutants for each chs were analyzed to study the role of each CHS during different developmental stages. Both, chs-6 and chs-7 exhibited an important role in vegetative growth; chs-5 and chs-7 were important during asexual reproduction; and chs-7 and chs-3 had a significant role during formation of sexual structures. These results suggest that there are different populations of chitosomes, each containing a class of CHS with specific roles during different developmental stages. Additionally, the traffic and delivery of PMA-1 were examined. In conidia, PMA-1-GFP was evenly distributed along the PM. During germ tube emergence and elongation, PMA-1-GFP was found all around the conidial PM and extended to the germ tube PM, but fluorescence was less intense or almost absent at the tip. In mature hyphae, PMA-1-GFP localized at the PM at distal regions (>120 μm) and in completely developed septa, but not at the tip, indicative of a distinct secretory route independent of the SPK occurring behind the apex. FRAP analysis revealed that the source of PMA-1-GFP newly incorporated to the PM, comes from source primarily the cytoplasm, whereas lateral diffusion from adjacent PM regions did not contribute significantly in the recovery of fluorescence in bleached areas. Brefeldin A (BFA), an inhibitor of the classical ER-to-Golgi secretory pathway, caused the disappearance of PMA-1-GFP found at tubular endomembranes in hyphal subapical regions, suggesting a role of these tubular endomembranes in protein recycling. Upon prolonged exposure to BFA, PMA-1-GFP started to accumulate in putative Brefeldin bodies. FRAP analysis of globular vacuoles in hyphae treated with BFA indicated that the endosomal recycling route was blocked by BFA. Finally, all the results suggested that CHS and PMA-1 take different secretory pathways. PMA-1-containing vesicles are incorporated directly into the PM away from the main secretory route for plasma membrane proteins that travel with the torrent of vesicles that accumulate in the SPK before being discharged into the apical plasma membrane, whereas CHS are concentrated in the core of the SPK before they are incorporated into the PM. | |
| CICESE | |
| 2013 | |
| Tesis de doctorado | |
| Español | |
| Fajardo Somera, R.A.2013.Tráfico vesicular de las proteínas quitina sintasas y la ATPasa de H+ de membrana plasmática durante el crecimiento de Neurospora crassa.Tesis de Doctorado en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. | |
| MICROBIOLOGÍA | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
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