Por favor, use este identificador para citar o enlazar este ítem:
http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/635| Expresión de la hormona hiperglucémica de crustáceos recombinante (rCHH-A) de Litopenaeus vannamei y su efecto en la modulación de los niveles de glucosa Expression of recombinant crustacean hyperglycemic hormone (rCHH-A) of the white shrimp Litopenaeus vannamei and it’s role in the modulation of glucose levels | |
| Roberto Carlos Arredondo Espinoza | |
| Elizabeth Ponce Rivas | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Hormona hiperglucémica | |
| La respuesta fisiológica de los crustáceos está regulada en gran medida por un conjunto neurohormonas de origen peptídico. La hormona hiperglucémica de crustáceos (CHH), el miembro más abundante de la familia peptídica CHH/MIH/GIH/MOIH, es producida en el pedúnculo ocular. De las tres isoformas de CHH que se han clonado de Litopenaeus vannamei, CHH-A resulta de gran interés ya que tiene el extremo C-terminal amidado, lo que pudiera ser importante para su actividad hiperglucémica. Este trabajo pretende llevar a cabo la clonación, expresión y purificación de la neurohormona CHH-A, utilizando los sistemas de expresión: E. coli BL21 DE3 y Pichia pastoris SMD1168H, con la finalidad de comparar los niveles de expresión de CHH-A entre los sistemas y evaluar su efecto en la regulación de los niveles de glucosa en L. vannamei. Para la clonación y mejor expresión de CHH-A, la secuencia del gen chhA fue optimizada con codones preferenciales para E. coli (plásmido CHHA-pUC57), amplificada por PCR y digerida con las mismas enzimas de restricción que el plásmido pET44a(+). Los productos fueron ligados y transformados a células de E. coli TOP10 y la construcción fue analizada por PCR y secuenciación. Asimismo, se montaron las condiciones para optimizar la expresión de CHH-A con un C-terminal adicional (c-myc, His-tag) en P. pastoris bajo el control de promotor inducible por metanol. Se probaron diferentes tiempos (24, 48 y 72 h) y concentraciones de metanol (1, 2 y 4%), encontrándose una mayor expresión con 2% de metanol a las 24 h de cultivo en medio complejo de nutrientes. rCHH-AHis fue purificada por cromatografía de afinidad, analizada por geles de Tricina-SDS-PAGE y su identidad corroborada utilizando anticuerpos contra el epítope c-myc. La hormona fue expresada, purificada y cuantificada a partir de un mayor volumen (100 ml), obteniéndose un rendimiento de 1.89 mg/L. Para determinar el efecto de rCHH-AHis en los niveles de glucosa de la hemolinfa del camarón, se inyectó la neurohormona a organismos juveniles a los cuales se les ablacionó un pedúnculo ocular, así como PBS y extracto de glándulas de dos pedúnculos oculares. Una hora post-inyección se tomó muestra de hemolinfa y la concentración de glucosa fue analizada. Los resultados mostraron que rCHH-AHis tuvo efecto en la modulación de los niveles de glucosa Most of the crustaceans physiology is regulated by a set of peptide neurohormones. The crustacean hyperglycemic hormone (CHH), the most abundant member of the peptide family CHH/MIH/GIH/MOIH, is produced in the eyestalk. From the three isoforms that have been already cloned in Litopenaeus vannamei, CHH-A is very interesting because it has the amidated C-terminal, which could be important for its hyperglycemic activity. This work intended to perform the cloning, expression and purification of the neurohormone CHH-A, using the expression systems: E. coli BL21 DE3 and Pichia pastoris SMD1168H, in order to compare the expression levels of CHH-A between the expression systems and its effect on the regulation of glucose levels in L. vannamei. For cloning and better expression of CHH-A, the chhA gene sequence was optimized with the preferential codons for E. coli (plasmid CHHA-pUC57), amplified by PCR, digested with the same restriction enzymes as the plasmid pET44a (+). The products were ligated and transformed into E. coli TOP10 cells and the construction was analyzed by PCR and sequencing. Furthermore, the conditions to optimize expression of CHH-A with an additional C- terminal (c-myc, 6xHis) were set in P. pastoris under the control of a methanol-inducible promoter. Different times (24, 48 and 72 h) and methanol concentration (1, 2 and 4%) were tested. Results showed an increased expression of rCHH-AHis with 2% methanol for 24 hours of culture using complex medium. rCHH-AHis was purified by affinity chromatography, analyzed by Tricine-SDS-PAGE gel and its identity was confirmed using antibodies against the c-myc epitope. The hormone was expressed, purified and quantified from a larger volume (100 ml) to give a yield of 1.89 mg / L. To determine the effect of rCHH-AHis on the glucose levels of the shrimp hemolymph, the neurohormone was injected to juvenile organisms unilaterally ablated as well as PBS and crude extract from two eyestalks. One hour post-injection a hemolymph sample was taken and glucose concentration determined. The results showed hyperglycemic activity of rCHH- AHis in the modulation of glucose levels | |
| CICESE | |
| 2014 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| Arredondo Espinoza, R.C.2014.Expresión de la hormona hiperglucémica de crustáceos recombinante (rCHH-A) de Litopenaeus vannamei y su efecto en la modulación de los niveles de glucosa.Tesis de Maestría en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. | |
| MICROBIOLOGÍA | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
Cargar archivos:
| Fichero | Descripción | Tamaño | Formato | |
|---|---|---|---|---|
| 237381.pdf | Versión completa de la tesis | 1.34 MB | Adobe PDF | Visualizar/Abrir |