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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/642| Biogénesis, transporte y localización de vesículas secretoras en el hongo filamentoso Neurospora crassa Biogenesis, transport and localization of secretory vesicles in the filamentous fungus Neurospora crassa | |
| Eddy Francisco Sánchez León-Hing | |
| Meritxell Riquelme Pérez | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Vesículas secretoras | |
| Los mecanismos de secreción en células eucariotas requieren la acción coordinada de las Rab GTPasas, que interactúan con la membrana de las vesículas secretoras promoviendo la asociación transitoria con otros factores y subsecuentemente la fusión de las vesículas con las membranas diana. A diferencia de otros modelos eucariotas, los hongos filamentosos poseen el Spitzenkörper (Spk), un complejo multivesicular que se encuentra en el ápice de las hifas en donde llegan las vesículas antes de ser re-dirigidas a la superficie celular en sitios de exocitosis. Hasta ahora, se desconoce con exactitud los mecanismos que la hifa utiliza para dar direccionalidad a las vesículas secretoras que llegan al Spk. Por lo tanto, hemos analizado las Rab GTPasas YPT-1 (Rab1), YPT-31 (Rab11) y SEC-4 (Rab8), reguladores clave en las distintas etapas de la ruta secretora en Saccharomyces cerevisiae y en células de mamíferos. Los análisis por microscopía confocal de escaneo con láser de las proteínas Rabs, etiquetadas con distintas versiones de proteinas fluorescentes, revelaron su localización en el Spk. Co-expresión de las distintas YPT-1 etiquetadas y las Rab GTPasas post-Golgi YPT-31 y SEC-4, revelaron que YPT-1 se encuentra confinada a la región microvesicular del Spk, mientras que SEC-4 y YPT-31 se encuentran distribuidas en la capa macrovesicular, sugiriendo que el tráfico de macrovesículas y microvesículas al o desde el Spk está regulado por las distintas Rabs. Notablemente, también se encontró en la estrato macrovesicular del Spk de N. crassa a la subunidad putativa del complejo β-1,3glucano sintasa FKS-1 y a la proteína secretada INV-1. YPT-1 también se detectó en distintas cisternas de Golgi a lo largo de las hifas. Los análisis de co-localización de YPT-1 y los marcadores de Golgi temprano USO-1 (p115) y VRG-4, y los marcadores de Golgi tardío SEC-7 y VPS-52 indicaron la participación de YPT-1 en el tráfico vesicular en cisternas de Golgi temprano y tardío. Análisis TIRFM (Microscopía de Reflexión Total Interna de la Fluorescencia) y quimográficos revelaron altas tasas de movimiento de las vesículas asociadas a YPT-1, que presentaron patrones de movimiento anterógrado y retrógrado; mientras que las cisternas de Golgi asociadas a YPT-1 presentaron un movimiento más lento y desplazamiento anterógrado. Las imágenes muestran la abundancia de YPT-1 en una mezcla de formas tubulares/vesiculares en zonas distales de la hifa similares a los Agregados Tubulares Vesiculares (VTCs). A través de los análisis FRAP (Recuperación de la Fluorescencia Después del Fotoblanqueado) se determinaron diferencias significativas en la dinámica de proteínas. De manera notable, se encontró que YPT-1 y YPT-31 mostraron tiempos medios de recuperación (t1/2) reducidos en comparación con los t1/2 de los marcadores del Spk estudiados (CHS-1, FKS-1, y FM4-64), revelando la posible asociación transitoria de estas Rabs con las vesículas del Spk. La localización de diferentes Rab GTPasas en regiones macro- y microvesiculares del Spk, sugieren su participación en el tráfico y entrega de vesículas secretoras involucradas en la síntesis de pared celular al Spk y la subsecuente descarga a la superficie celular. In eukaryotic cells secretion mechanisms require the coordinated action of small Rab GTPases, which interact with the membrane of vesicles and promote the association with other factors and the subsequent fusion of the vesicles with a target membrane. In contrast to other eukaryotic model systems, filamentous fungi contain the Spitzenkörper (Spk), a multi-vesicular complex found at the hyphal apex to which cargo-carrying vesicles arrive before being redirected to specific cell sites. The exact regulatory mechanisms utilized by hyphae to give directionality to the secretory vesicles that reach the Spk are still unknown. Hence, we have analyzed the N. crassa Rab-GTPases YPT-1 (Rab1), YPT-31 (Rab11) and SEC-4 (Rab8), key regulators of distinct traffic steps of the secretory pathway in Saccharomyces cerevisiae and mammals. Laser scanning confocal microscopy of strains expressing fluorescently tagged versions of the Rabs revealed their localization at the Spk. Co-expression of differently labeled YPT-1 and the post-Golgi Rab GTPases YPT-31 and SEC-4 showed that YPT-1 was confined at the microvesicular core of the Spk, while SEC-4 and YPT-31 localized in the Spk peripheral macrovesicular layer, suggesting that trafficking of macro and microvesicles of the Spk are regulated by distinct Rabs. Notably, we also found at the Spk outer layer the N. crassa putative β-1,3-glucan synthase complex subunit FKS-1 and the secreted protein (INV-1). YPT-1 was also found distributed at distinct Golgi cisternae along the hyphae. Co-localization analysis of YPT-1 with the early Golgi markers USO-1 (p115) and VRG-4, and the late Golgi markers SEC-7 and VPS-52 indicated the participation of YPT-1 at early and late Golgi vesicle trafficking steps. TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy) and Kymograph analyses revealed high moving rates of the YPT-1associated vesicles, which displayed anterograde and retrograde movement patterns, while the YPT-1-associated Golgi cisternae moved more slowly and anterogradely. Image analysis revealed the abundance of YPT-1 in a mix of tubular/vesicular-like structures at distal hyphal regions, which resembled the mammalian Vesicular Tubular Clusters (VTCs). Through FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) analysis conspicuous differences in protein dynamics were determined. Remarkably, YPT-1 and YPT-31 showed lower half-time recovery rates (t1/2) than other Spk markers (i.e. CHS-1, FKS-1, and FM4-64), suggesting a transient association of these Rab GTPases with the vesicles of the Spk. The localization of the distinct Rab GTPases at macro- and microvesicular regions of the Spk suggest their participation in the traffic and delivery of cell wall building vesicles toward the Spk and their subsequent discharge to the apical cell surface. | |
| CICESE | |
| 2015 | |
| Tesis de doctorado | |
| Español | |
| Sánchez León-Hing, E.F.2015.Biogénesis, transporte y localización de vesículas secretoras en el hongo filamentoso Neurospora crassa.Tesis de Doctorado en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. | |
| MICROBIOLOGÍA | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
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