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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/657| Clonación y expresión de la conotoxina recombinante cal26a de Conus californicus en Escherichia coli Cloning and expression of recombinant conotoxin cal26a from Conus californicus in Escherichia coli | |
| Jahaziel Gasperin Bulbarela | |
| Edna Sánchez Castrejón | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Conotoxinas | |
| Las conotoxinas son péptidos de longitud menor a 50 aminoácidos, ricos en enlaces disulfuro, las cuales son producidas por los caracoles del género Conus y empleados para paralizar a sus presas como estrategia de defensa y/o alimentación. Estos péptidos son ligandos de diferentes blancos moleculares, entre los que se encuentran canales iónicos y receptores membranales. Como consecuencia de su gran afinidad y especificidad a su blanco molecular, estas toxinas representan una fuente potencial para el desarrollo de nuevos fármacos. El estudio de las conotoxinas se ve limitado por la dificultad que representa su obtención por vías naturales, ya que se requiere de la disección de una gran cantidad de especímenes para recabar suficiente material biológico para su análisis. Una alternativa a esto es la producción de proteínas recombinantes, la cual se basa en la clonación del gen que codifica para la conotoxina y su producción en sistema de expresión así como su posterior purificación. En este proyecto se plantea como objetivo obtener la conotoxina cal26a de manera recombinante en E. coli para su análisis de actividad, así como para su posterior empleo en estudios de estructura y caracterización de blancos moleculares, entre otros. Para lo cual se diseñaron cinco construcciones empleando el vector pET-22b (+), cal26a-His, His-cal26a1-2 y His-SP-cal26a1-2, para su expresión con la cepa BL21 (DE3). Solo cal26aHis fue expresado en cantidades suficientes para su evaluación, pero permaneció unido al péptido señal (pelB) y formó cuerpos de inclusión. Los agregados fueron aislados y cal26a-Hisr purificada en condiciones desnaturalizantes, obteniendo un rendimiento de 1.19 mg/L. La proteína recombinante fue replegada en columna de Ni-NTA mediante dos soluciones renaturalizantes, Tris-HCl 20 mM y Tris-HCl 20mM adicionado con glicina 10 mM. Un ensayo preliminar de actividad contra M. tuberculosis mostró una tendencia de inhibición del crecimiento, donde cal26a-Hisr renaturalizado con glicina pl_8 µg/mL redujo la actividad en un 20 % en comparación con el control, sin embargo estudios posteriores deben ser realizados para corroborar su actividad. Conotoxins are peptides rich in disulfide bonds with less than 50 amino acids in length. These are produced by snails of the Conus genus which employ them to paralyze their prey as a feeding/defensive strategy. These peptides are ligands of different molecular targets, among which are ion channels and membrane receptors. Because of their high affinity and specificity to their molecular targets, these toxins represent a potential source for developing new drugs. Conotoxins research is limited by the difficulty of obtaining them the native way, as it requires dissection of a large number of specimens to obtain sufficient biological material for analysis. An alternative to this is the production of recombinant proteins, which is based on the cloning of the gene encoding the conotoxin and its expression in a protein production system and further purification. This project therefore seeks to obtain the conotoxin cal26a recombinantly in E. coli for analysis of activity as well as for subsequent use in studies of structure and characterization of molecular targets, among others. For this purpose five constructs were designed using the vector pET22b(+), cal26a-His, His-cal26a1-2 and His-SP-cal26a1-2, for expression in the BL21 (DE3) strain. Only cal26a-His was expressed in quantities sufficient for evaluation, but remained attached to the signal peptide (pelB) and formed inclusion bodies. The aggregates were isolated and cal26a-Hisr purified in denaturing conditions, obtaining a yield of 1.19 mg/L. The recombinant protein was refolded on Ni-NTA column through two renaturing solution, 20 mM Tris-HCl and 20 mM Tris-HCl supplemented with 10 mM glycine. A preliminary test of activity against M. tuberculosis showed a trend of growth inhibition, where cal26a-Hisr renatured with glycine pl_8 µg/mL reduced the activity by 20 % compared to control, but further studies must be performed to corroborate its activity. | |
| CICESE | |
| 2015 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| Gasperin Bulbarela, J.2015.Clonación y expresión de la conotoxina recombinante cal26a de Conus californicus en Escherichia coli.Tesis de Maestría en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. | |
| MICROBIOLOGÍA | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Ciencias de la Vida |
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