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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/3758| Optimización de la lactato oxidasa de Aerococcus viridans para la transferencia directa de electrones en biosensores Optimization of Aerococcus viridans lactate oxidase for direct electron transfer in biosensors | |
| David Morales Gutiérrez | |
| ANDRES ZARATE ROMERO | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Lactato oxidasa, biosensor, nanocúmulo de platino, inmovilización molecular orientada, DET Lactate oxidase, biosensor, platinum nanocluster, molecularly oriented immobilization, DET | |
| En ocasiones las enzimas obtenidas directamente de los organismos que las producen no cuentan con las características óptimas para usos en biodetección, por lo que la optimización de estas ha sido foco de investigación. Una de las enzimas que ha captado especial atención es la L-Lactato oxidasa (LOx), que se utiliza para la detección de L-lactato en diagnóstico clínico, así como para el control de procesos fermentativos. Por otro lado, las primeras generaciones de biosensores usan oxígeno o mediadores redox para la transferencia de electrones, lo cual limita su aplicabilidad en dispositivos implantables, por lo que la transferencia directa de electrones (DET) apunta a ser una mejor alternativa para una biodetección eficiente. En el presente trabajo se optimizó la LOx de Aerococcus viridans por apertura del sitio catalítico (para la creación de nanocúmulos de platino) o por inmovilización molecular orientada en superficies de oro para eficientizar la DET en biosensores amperométricos. Se diseñaron 3 mutantes para la apertura del sitio activo en el que se cambió la arginina 181 por residuos hidrofóbicos de cadena más corta (R181A, R181V Y R181I) y una mutante para el anclaje a superficies de oro donde se sustituyó la lisina 188 por cisteína (K188C). Todas las mutantes se expresaron en E. coli BL21 (DE3) y purificaron en 2 pasos (cromatografía de afinidad a níquel y cromatografía de intercambio iónico). Los ensayos de actividad mostraron una disminución de la actividad de las 4 mutantes con respecto a la enzima de tipo silvestre; sin embargo, la afinidad al sustrato (Km) de las mutantes R181V y K188C no fue afectada. La creación de nanocúmulos de platino se caracterizaró por DLS, el ensayo mostró partículas de entre 500 y 1000 nm, mostrando indicios de una DET. Por otra parte, las pruebas de anclaje de la mutante K188C evidenciaron una superficie de oro con enzima inmovilizada y activa; así mismo, los ensayos electroquímicos mostraron un pico redox en presencia de sustrato y una respuesta amperométrica dependiente de la concentración de lactato en ausencia de mediadores lo que demuestra que la mutante K188C es capaz de llevar a cabo la DET. The enzymes obtained directly from the organisms usually do not have the optimal characteristics for its use in biosensors. Thus, the optimization of these enzymes has been the focus of research. Among these enzymes L-lactate oxidase (LOx) is gained attention. LOx is used for the detection of L-lactate in clinical diagnostics or in the control of fermentation processes. On the other hand, the first generations of biosensors use oxygen or redox mediators for electron transfer, which limits their applicability in implantable devices, so direct electron transfer (DET) appears to be a better alternative for efficient biodetection. Therefore, in the present work, the LOx of Aerococcus viridans was optimized in two ways: first by opening the catalytic site (for the creation of platinum nanoclusters) and by producing a molecularly oriented immobilization on gold surfaces for efficient direct electron transfer in amperometric biosensors. Three mutants were designed to opening the active site where arginine 181 was replaced by shorter chain hydrophobic residues (R181A, R181V and R181I). On the other hand, a mutant for anchoring to gold surfaces was produced where lysine 188 was replaced by cysteine (K188C). All mutants were expressed in E. coli BL21 (DE3) and purified in 2 steps (nickel affinity chromatography and ion exchange chromatography). Activity assays showed a decrease in activity of the 4 mutants with respect to the wild-type enzyme, however, the substrate affinity (Km) of the R181V and K188C mutants was not affected. To test the creation of platinum nanoclusters they were characterized by DLS, the assay showed particles between 500 and 1000 nm, and the electrochemical assays suggested a DET. On the other side, anchoring tests of the K188C mutant evidenced a gold surface with immobilized and active enzyme, and electrochemical assays showed a redox peak in the presence of substrate and an amperometric response dependent on lactate concentration in the absence of mediators, these results demonstrate that K188C is capable to perform a DET. | |
| CICESE | |
| 2022 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| Morales Gutiérrez, D. 2022. Optimización de la lactato oxidasa de Aerococcus viridans para la transferencia directa de electrones en biosensores. Tesis de Maestría en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 79 pp. | |
| PROPIEDADES DE LOS MATERIALES | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Nanociencias |
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