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http://cicese.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1007/4141| Evaluación de biosensores amperométricos basados en mutantes de la Arg 181 de la lactato oxidasa de Aerococcus viridans Evaluation of amperometric biosensors based on Arg 181 mutants of lactate oxidase from Aerococcus viridans | |
| Irma Yomira Palomares Ruiz | |
| ANDRES ZARATE ROMERO | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución | |
| Lactato oxidasa, biosensor, nanocúmulo de platino, DET y MET. Lactate oxidase, biosensor, platinum nanocluster, DET y MET | |
| El lactato es un biomarcador importante en la industria, salud y deporte, pero su cuantificación presenta desafíos debido a métodos tradicionales costosos y laboriosos. Esta investigación desarrolló biosensores amperométricos basados en mutantes de Lactato Oxidasa (LOx) para medir lactato en el sudor, ofreciendo una alternativa más eficiente. Se crearon biosensores de segunda generación con mediadores para mejorar la transferencia de electrones y de tercera generación con núcleos de platino para la transferencia directa de electrones (DET), ampliando así el rango de detección de lactato. Para conseguirlo, se decidió utilizar mutantes de la enzima LOx de Aerococcus viridans donde se sustituyó la Arg181 por los residuos hidrofóbicos Valina, Isoleucina y Alanina, (R181V, R181I y R181A). Esto permitió la formación de núcleos de platino en el sitio activo, actuando como nanocables para la DET. Todas las mutantes se expresaron en E. coli BL21 y se purificaron en un solo paso mediante cromatografía de afinidad a níquel. Los ensayos mostraron que los biosensores de segunda generación con quitosano y azul de Prusia resultaron efectivos para detectar lactato. A pH 5.0, las mutantes no mostraron un incremento de corriente, sugiriendo su posible inactivación debido a la protonación del residuo His265. En cuanto a los biosensores de tercera generación, la formación de nanocúmulos de platino se caracterizó por DLS, mostrando partículas de entre 500 y 1000 nm, indicando una DET. Los resultados indicaron que la enzima silvestre en pH 5.0 como 7.0, no exhibió una transferencia de electrones. En contraste, R181V mostró una DET a pH 7.0. En la amperometría, se observó un aumento continuo de potencial a una concentración de 30 mM de lactato, indicando estabilidad y superando el umbral de concentraciones de lactato en el sudor. Sin embargo, a pH 5.0 se perdió totalmente la transferencia de electrones, posiblemente debido a la inactivación de la enzima en este ambiente ácido. Estos hallazgos subrayan la necesidad de modificar la enzima para mejorar la transferencia de electrones en biosensores de tercera generación y la importancia del pH en la actividad enzimática y transferencia de electrones para el diseño de biosensores para sudor humano. Lactate is an important biomarker in industry, health, and sports, but its quantification presents challenges due to traditional methods being costly and labor-intensive. This research developed amperometric biosensors based on Lactate Oxidase (LOx) mutants to measure lactate in sweat, offering a more efficient alternative. Second-generation biosensors were created with mediators to enhance electron transfer, and third-generation biosensors with platinum nuclei for direct electron transfer (DET), thus expanding the lactate detection range. To achieve this, mutants of the LOx enzyme from Aerococcus viridans were used, where Arg181 was replaced by the hydrophobic residues Valine, Isoleucine, and Alanine (R181V, R181I, and R181A). This allowed the formation of platinum nuclei in the active site, acting as nanowires for DET. All mutants were expressed in E. coli BL21 and purified in a single step using nickel affinity chromatography. Assays showed that second-generation biosensors with chitosan and Prussian blue were effective in detecting lactate. At pH 5.0, the mutants did not show an increase in current, suggesting their possible inactivation due to protonation of the His265 residue. Regarding the third-generation biosensors, the formation of platinum nanoclusters was characterized by DLS, showing particles between 500 and 1000 nm, indicating DET. The results indicated that the wild-type enzyme at pH 5.0 and 7.0 did not exhibit electron transfer. In contrast, R181V showed DET at pH 7.0. In amperometry, a continuous potential increase was observed at a lactate concentration of 30 mM, indicating stability and surpassing the threshold of lactate concentrations in sweat. However, at pH 5.0, electron transfer was completely lost, possibly due to enzyme inactivation in this acidic environment. These findings underscore the need to modify the enzyme to improve electron transfer in third-generation biosensors and the importance of pH in enzymatic activity and electron transfer for the design of biosensors for human sweat. | |
| CICESE | |
| 2024 | |
| Tesis de maestría | |
| Español | |
| Palomares Ruiz, I.Y. 2024. Evaluación de biosensores amperométricos basados en mutantes de la Arg 181 de la lactato oxidasa de Aerococcus viridans. Tesis de Maestría en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 57 pp. | |
| PROPIEDADES DE LOS MATERIALES | |
| Aparece en las colecciones: | Tesis - Nanociencias |
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| tesis_Irma Yomira Palomares Ruiz_07 ago 2024.pdf | Descripción completa de la tesis | 2.46 MB | Adobe PDF | Visualizar/Abrir |